| 研究課題/領域番号 |
06680584
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
高尾 敏文 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (10197048)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1995年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1994年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | キャピラリーHPLC / エレクトロスプレーイオン化 / 質量分析 / 遺伝子組み換え蛋白質 / 蛋白質翻訳後修飾 / ペプチドマッピング / ブロッティング / 疎水性膜 / 蛋白質の一次構造解析 / 安定同位体 / カルボキシ末端ペプチド / 微量試量 / イオン化効率 / 分子量測定 / 蛋白質のブロッティング |
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| 研究概要 |
本研究では、微量蛋白質構造解析用オンライン分離・分析法を確立することを目的に、エレクトロスプレーイオン源を装着した磁場型高分解能タンデム質量分析装置(現有設備)に内径0.3mm以下の細管カラムを用いて分離が行えるキャピラリー高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を接続した。質量分析及びキャピラリーHPLCにおける種々の条件検討、改良を行うことにより、磁場型質量分析計において世界で初めて微量試料のHPLC/MSが行えることを示した。その結果、微量試料の分離、構成成分の正確格な分子量による同定を同時に行うことができるようになった。蛋白質の構造解析においては、分子量による同定や様々な酵素によるペプチドマッピングを20ピコモル以下の微量で行うことができ、特にDNA塩基配列から推定された蛋白質、あるいは遺伝子組換え技術によって産生された蛋白質のアミノ酸配列、及び蛋白質翻訳後修飾の解析に有効である。実例として、植物由来のフェレドキシン、及びグルタミン合成酵素に見いだされた4種のアイソザイムの同定、遺伝子組み換え技術により産生された数種の蛋白質の一次構造の同定を行った。また、キャピラリーHPLCに微量溶出液を疎水性膜上にブロットできるマイクロブロットコーダー(平成6年度設備備品)を接続し、膜上に分離、回収される試料を他の分析法(アミノ酸分析、アミノ酸配列分析等)に供し、その応用性を評価した。その結果、キャピラリーHPLCにより分離された試料は90%以上という高効率で疎水膜上にブロッティングされることがわかった。この装置をキャピラリーHPLC/MSに接続することで質量分析による目的物質の分子量による同定と共に、膜上に回収される試料を既存の蛋白質化学的分析法に供することが可能となった。
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