| 研究概要 |
アミノ基転移酵素のほとんどはモノカルボン酸である中性アミノ酸とジカルボン酸である2-オキソグルタル酸のアミノ基転移反応を触媒する。本研究はこのような全く性質の異なる基質が一つの活性部位で認識される機構を大腸菌芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素(ArAT)について研究することを目的とするものである。
1.ArATの二種の基質(ジカルボン酸基質と芳香族基質)のうち,ジカルボン酸基質はArg292(遠位カルボキシル基)とArg386(近位カルボキシル基)によって認識される。同残基からAsn194を介して補酵素PLPの3'-Oに至る水素結合ネットワークは基質の結合に伴ってPLPの電子状態が触媒に最適化する機構において中心的な役割を担っている。これはα-カルボキシル基がすべてのアミノ酸基質に共通の構造であり,α-カルボキシル基による反応促進機構がアミノ基転移酵素に普遍的なものであることを反映している。
2.β-ヒドロキシル化偽基質と野生型およびTyr70Phe置換型ArATの反応の解析により二種の基質は同一のコンフォメーションでArATに結合することが判明した。また芳香族基質認識時にはArg292側鎖は酸性基質認識時とは異なるコンフォメーションをとる必要があることが判明した。
3.Arg292変異酵素と基質の反応の解析により、Arg292のグアニジノ基の存在が基質芳香環の認識に重要であること,すなわちArg292の側鎖が基質芳香環結合部位の一部を構成するか,あるいはその形成過程において必須であることが明らかになった。
4.上述の知見を更に原子レベルで追及するためにX-線結晶解析が不可欠であり,そのために良好な結晶を得ることのできる酵素としてParacoccus denitrificans酵素が最適であることを見出だし,現在同酵素単独および基質アナログ結合時の立体構造を解析中である。
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