| 研究課題/領域番号 |
06740572
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
遺伝
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| 研究機関 | 理化学研究所 |
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研究代表者 |
磯田 和良 理化学研究所, 分子遺伝学研究室, 基礎科学特別研究員 (50261160)
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| 研究期間 (年度) |
1994
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| 研究課題ステータス |
完了 (1994年度)
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| 配分額 *注記 |
1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1994年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | SS結合 / 架橋 / ショウジョウバエ / 極性 / シグナル伝達系 / 分子遺伝学 / 複合性 / 2次元電気泳動 |
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| 研究概要 |
1.Tube抗体及びPelle抗体の調製Tube遺伝子の全長を大腸菌中で大量発現、精製し高原を調製。得られた抗血清はショウジョウバエ初期胚抽出液中のTube以外の3個の蛋白質と強くクロス反応した。アフィニティー精製によってもこれらのクロス反応は全く除けなかった。現在、Tube全長ではなくその一部を抗原として、より特異性の高い抗体をとることを計画中である。Pelleについては、グルタチオントランスフェラーゼとの融合蛋白質を用いて抗血清を調製した。大腸菌アセトンパウダーによる吸収により、ほぼPelle特異的抗体が得られた。
2.SS架橋法による複合体検出:調整した抗体を用いてTube及びPelleの複合体の検出を試みた。Tubeに関しては、クロス反応する蛋白質によるノイズと、これらの蛋白質の複合体によるノイズのために、Tube複合体は検出できなかった。Pelle複合体に関してもバックグラウンドのノイズが高く、微量の複合体が検出できるだけのS/N比が得られなかった。そこで、より特異性が高くハイアフィニティーの抗体の再調製を進めると共に、SS架橋法の検出方法の改良を試みた。
3.より高分解能の解析法の開発:これまでは架橋された複合体をSDS-PAGEで一次元的にフラクショネートしていたのでバンドが混みあい、少しでもクロス反応があると複合体の検出が妨げられた。複合体の2次元面状に展開できればシグナル同志が重なり合う確立は遙かに低くできると考え、架橋処理後、細胞抽出液を2次元電気泳動でフラクショネートする方法の開発を試みた。材料として集めやすい培養細胞系を用い、cAMPシグナル伝達系に関与する転写因子CREBP1の複合体の検出をモデル実験として、種々の条件設定を行い、一般的な方法として確立できたので、現在、Tube及びPelle複合体検出への適用を開始しているところである。
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