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本研究の最初の段階として、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)におけるアコニチンの最適な分離条件を決定するために、通常のHPLCを用いて種々の移動相について検討した。このときのアコニチンと内部標準のメチルリカコニチンの検出は、234nmの紫外部の吸収によって行った。20mM酢酸アンモニウム(pH=7.0):アセトニトリル=50:50(v/v)の移動相はアコニチンと内部標準を良く分離し、アコニチンは6.5分に、内部標準は5.4分に検出された。
次に、液体中からのアコニチンと内部標準の精製の条件について決定した。最も良く使われるカラムであるイオン交換樹脂のBondElut Certifyと疎水性のSep-Pak C_<18>とを比較した。BondElut Certifyを用いて1mlの尿からそれぞれ50μgのアコニチンと内部標準を精製したところ、回収率はアコニチンが97.4±7.3%(mean±SD、n=3)、内部標準が101±4.3%であり、紫外部の吸収においては妨害ピークも殆ど認められなかった。Sep-Pak C_<18>カラムを用い、クロロフォルム:メタノール(8:2)で溶出した場合の回収率は、アコニチンで67.9±21%、内部標準で74.5±12%であり、BondElut Certifyが、体液からのアコニチンの精製に有効であることが示唆された。
これらの結果を踏まえて、アコニチンと内部標準の標準品をHPLC/FAB-MSに注入し、マススペクトルを測定し、positive FABとNegative FABを測定したが、Positive FABの方が感度は良好であった。アコニチン、内部標準共に分子ピークを検出することができ、アコニチンは、m/z646、629、613、588、105、内部標準は、m/z682、617、586、216、188、146、115、92のフラグメントが得られた。現在、これらのフラグメンテーションの解析と感度限界の検討を行なっており、これらの実験が完了した後に、結果を雑誌に投稿する予定である。
最近HPLC/MSの新しいイオン化法として、大気圧化学イオン化法(APCI)が開発され、従来のHPLC/MSの10倍以上の感度が得られると報告されている。アコニチンは比較的イオン化が困難であり、高感度を得るためには、APCIの方が望ましいと思われる。今後APCI法を用いたアコニチンの検出同定も行ないたいと考えている。
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