| 研究概要 |
かゆみ成立の神経学的機序を解析するため皮膚における化学受容線維の伝達物質を検索した。まず末梢からの刺激伝達による脊髄後角ニューロンでのFos蛋白発現を確認するため,ペントバルビタール麻酔下でラットの後肢足底に5%ホルマリン0.1mlを局注し,その2時間後,エーテル麻酔下に0.1Mヘパリン加リン酸緩衝液で潅流した後,Zamboni液で潅流固定を行い脊髄を摘出した。摘出した脊髄はさらに24時間浸漬固定し,洗浄して凍結し,厚さ20μmに薄切して,Fos蛋白特異的な抗体を用いてavidin-biotin complex methodによる免疫染色を行った。発色にはdiaminopenzidineを用いた。その結果,当初用いた2種類の抗体(Oncogene Science社ウサギポリクローナル抗Fos蛋白抗体(Ab-2),Cambridge Research Biochemicals社ヒツジポリクローナル抗Fos蛋白抗体(OA-11-825))では脊髄後角ニューロンにおけるFos蛋白の発現は検出することができず,Cambridge Research Biochemicals社ヒツジポリクローナル抗Fos蛋白抗体(OA-11-824)でのみFos蛋白の発現を確認することができた。そこでこの抗体を用いて,以下の実験を行った。ラットの後肢前面を剃毛し,その24時間後にペントバルビタール麻酔下で同部位に500mg/mlの濃度でヒスタミンを溶解した生理食塩水を塗布し,プラスチック性のピペットチップで軽く20回掻破を行った。処置の2時間後に上記方法で潅流固定し摘出した脊髄を凍結切片とし免疫染色を行った。その結果シスタミン刺激によっても脊髄後角ニューロンにFos蛋白が発現することを確認した。しかし,ホルマリンによる刺激と比較してFos蛋白を発現する細胞はより少数で,ほぼ後角のI層に限局して見られた。現在,ヒスタミンアンタゴニストを投与してこれらのニューロンにおけるFos蛋白発現の変化を検討中である。
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