| 研究概要 |
1.ヒトprolactin(PRL)cDNAを含むプラスミドのpBR322を大腸菌X1776を培養させることによって増やした。つまりBacto-typtoneとBacto-yeast extractにて培養液をつくり、同時にplateも用意した。small scaleでX1776を一晩培養した後、plateに塗り、コロニーを選びだし、更に大量に培養した。増殖したX1776からプラスミドを回収、精製した。結果として、4tubeからそれぞれtotal 374μg,329μg,420μg,328μgのpBR322を得た。
2.上記の如く得られたプラスミドからPRLcDNAを増幅して得るためPCRを行った。条件はpolymerase72℃1分間、annealing55℃,1分間、denature94℃,1分間で30cycle行った。PRLcDNAは単一のバンドとして電気泳動上確認された。
3.RNAは正期産の卵膜より羊膜、絨毛膜、脱落膜を分離しGIT/CsClによる変性と超遠心法(100000rpm,12時間)によって抽出した。これらのRNAと上記のPRLcDNAのDNAprobe(α-p^<32>)によってNorthern analysisを行った。絨毛にのみ約1.1kbの位置にバンドを認め、絨毛にPRLのmRNAが発現していることが確認された。
4.今後、同様の方法を用いて、PRL recepterの発現も観察し、培養細胞を用いて、PRLならびにPRL receptorの発現調節を検討したあと、Na-K ATPase活性の変化を追跡する予定である。
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