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1.人唾液腺眼細胞株の培養、培養上清の採取およびその濃縮。2.MicroplateのアビジンコートおよびBSAによるブロッキング。3.Biotin-NHSによるV型コラーゲンのピチオン化。
4.コラゲナーゼ活性の測定・・・1。
(1)アビジンコートしたMicroplateにビオチン化したV型コラーゲンを添加し、incubate後に各wellを洗浄。(2)Microplateに濃縮した培養上清サンプルを添加し、決められたTime courseに従ってincubateする。(3)Incubateした培養上清を別のアビジンコートしたMicroplateに移し、アビジン-ペルオキシダーゼを添加しincubateする。(4)各wellをPBSで洗浄後、基質として4-クロロ-1-ナフトールを添加しIncubate後に、Microplate readerで及光度を測定。
上記計画に従って研究を進めた結果、及光度に一定の規則性を欠いたため、以下の計画に従って培養上清のコラゲナーゼ活性を測定。
5.コラゲナーゼ活性の測定・・・2。
(1)V型コラーゲンに濃縮した培養上清サンプルを添加、決められたTime courseに従ってincubateした後にProtease inhibitorよって反応を停止し、サンプルを還元条件下で電気泳動する。
(2)ニトロセルロース膜に転写しBSAでBlocking後に、免疫学的な手段を用いて発色。
その結果、Time courseの短いケースに切断されたV型コラーゲンの断片が出現し、培養上清中にV型コラゲナーゼ活性の存在することが確認された。現在は、当初の計画通りMicroplateを用いて少量のコラーゲン基質で高感度にコラゲナーゼ活性を測定できるよう、コラーゲンのビオチン化、Time-course等を研究中である。
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