酵母液胞型プロトン輸送性ATP分解酵素サブユニットの機能と分子多様性に関する研究

• 研究課題/領域番号: 06772174
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 平田 龍吾 理化学研究所, 動物・細胞システム研究室, 研究員 (60260197)
• 研究期間 (年度): 1994
• 研究課題ステータス: 完了 (1994年度)
• 配分額: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 1994年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
• キーワード: 酵母 / 液胞型ATPase / H^+-ATPase / 液胞 / 酸性化 / サブユニット

研究概要

酵母液胞膜V-ATPaseの17-kDaサブユニット(Vma3p)は、プロトンの輸送に直接機能していると考えられているが、このサブユニットには、遺伝子レベルで同定された相同的な分子VmallpとPpalpが存在する。平成6年度はVma3pとVmallpについて解析した。
1.17-kDaサブユニットおよびその相同分子の抗体による検出系の構築
互いに相同的な遺伝子産物を特異的に検出する系を構築する目的で、Vma3pのC末端領域に抗c-myc抗体のエピトープを含む10アミノ酸を融合した産物を発現する組換え体を構築した。この株は、野生株を同じレベルの液胞膜V-ATPase活性を有した。また、抗c-myc抗体に反応し、予想される分子量のポリペプチドが融合遺伝子の発現に特異的に認められた。この系をVmallpやPpalpに応用することで、これらの遺伝子産物の特異的検出系を構築できると考える。
2.Vmallpの保存性グルタミン酸残基の変異株の解析
Vma3pでプロトンの輸送に機能すると考えられているグルタミン酸残基がVmallpの配列中にも保存されている。Vmallpの保存性グルタミン酸残基をロイシンに置換した変異株では、液胞膜上に野生型酵素と同じサブユニット構成の複合体が形成されていたが、V-ATPase活性は失われていた。この結果から、Vmallpは、液胞膜V-ATPaseの分子集合形成などに間接的に機能しているのではなく、サブユニットとして機能していると考える。また、野生株では、液胞膜に結合したサブユニットの一部が部分複合体として存在していると考えられているが、この変異株では、ほとんどがホロ酵素複合体様の構造を取っていた。液胞内酸性化が起きない変異株でより多くの酵素複合体が検出されたことから、液胞内酸性化の度合いに応じて、液胞膜への酵素結合量が変化し、酸性化の調節が行われている可能性が示唆された。