| 研究概要 |
傾斜固定後1時間のあて材形成初期に発現している遺伝子のcDNAの単離を試みた。全RNAの抽出はさらに改良し、VRC(Vanadyl Ribonucleoside Complex)を抽出用緩衝液に加えることによって、安定的にしかも夾雑物の少ない全RNAを得られるようになった。傾斜固定後1時間の樹幹上側の木部分化帯から抽出した全RNAをOligo-dT Cellulose スパンカラム(Pharmacia)に通し、mRNA画分を得た。得られたmRNAからTimesaver(Pharmacia)を用いてcDNA二重鎖を合成し、これをλgtllに組み込みGigapack II Gold(Stratagene)を用いてパッケージング、99.9%以上の転換効率で形質転換体ファージによるcDNAライブラリを構築した。このライブラリは約50,000クローンからなり、1回増幅させて約10^<10>pfu/mlのタイタ-を得た。他方、同じく傾斜固定後1時間の木部分化帯から得られたmRNAをテンプレートにOligo-dTをプライマーとし、Superscript(BRL)を用いて^<32>P-α-dCTPを取り込ませてcDNAを合成し、これをSubtractor II(Invitrogen)を用いて鉛直に成長中の木部分化帯から得られたmRNAによってサブトラクションした。サブトラクションは2回行い、^<32>Pの放射活性を測定したところ、1回目で約13%、2回目で約3.8%の効率でサブトラクションされた。得られた^<32>PラベルのサブトラクテドcDNAをプローブとして用い、先に構築したcDNAライブラリの2×10^5 plaqueに対してプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行なった。スクリーニングの結果、48個のポジティブプラークが得られた。
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