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1)牛眼網膜から視細胞層を取り除くための層間剥離
transducinαに相同なG蛋白をクローニングするため、transducinαのmRNAをなるべく含まないRNAを網膜から抽出する必要がある。フィルター紙を網膜の硝子体側から接着させてからはぎ取ることによって網膜から効率よく視細胞を取り除くことができた。残った網膜組織からRNAを抽出した。
2)degenerateprimerを用いたpolymerasechainreaction(PCR)
三量体G蛋白αサブユニットの塩基配列に広く保存された領域3カ所を選択してdegenerateprimerを3組設計した。1)で得られたRNAを鋳型にしてPCRを行い、増幅産物を得た。
3)transducinα cDNAの除去とサブクローニング
rod transducinα cDNAを消化する制限酵素で2)で得られたPCR産物を消化した後に電気泳動を行い、想定長のPCR産物のみを切り出すことでrod transducinα cDNAを除去した。このcDNAをプラスミドベクターにサブクローニングした。
4)PCR産物の塩基配列決定
DNAシーケンサーでサブクローニングしたPCR産物(全30種)の塩基配列を決定した。既知のG蛋白αサブユニット(Gq)が2種、cone transducinα、酵母のある酵素の相同蛋白1種、相同性のない未知の配列1種、transducin αに低い相同性をもつ未知の配列1種を得た。
現在、未知の配列2種について検討を進めるとともに、全長配列を得るため、材料としたRNAよりcDNAライブラリーを作成している。
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