蛋白質の核形成と結晶成長カイネティックス

• 研究課題/領域番号: 07044057
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 小松 啓 東北大学, 金属材料研究所, 教授 (00108565)
• 研究分担者: THOMAS Bill アラバマ大学, マイクログラビティーセンター, 助手 ; MUSCHOL Mart アラバマ大学, マイクログラビティーセンター, 助手 ; VEKILOV Pete アラバマ大学, マイクログラビティーセンター, 助手 ; ROSENBERGER フランツ アラバマ大学, マイクログラビティーセンター, 教授 ; 佐崎 元 東北大学, 金属材料研究所, 助手 (60261509) ; 中田 俊隆 東北大学, 金属材料研究所, 助手 (20237308) ; 宮下 哲 東北大学, 金属材料研究所, 助手 (00219776) ; 帯刀 益夫 東北大学, 加齢医学研究所, 教授 (10099971) ; MUSHOL Martin Center for Microgravity and Materials Research, University of Alabama ; FRANZ Rosenb アラバマ大学マイクログラビティーセンター, 教授
• 研究期間 (年度): 1995 – 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 9,200千円 (直接経費: 9,200千円); 1996年度: 4,300千円 (直接経費: 4,300千円); 1995年度: 4,900千円 (直接経費: 4,900千円)
• キーワード: 蛋白質 / リゾチーム / 結晶成長 / 不純物効果 / 二光束干渉法 / 光散乱法 / 溶解度 / 磁場効果 / タンパク質 / 濃度分布

研究概要

平成8年度に得た成果を以下にまとめる。
1.日本側は二光束干渉法を使って卵白リゾチームの正方晶系、斜方晶系、三斜晶系結晶についての溶解度測定を行い、溶解度の温度依存性から溶解のエンタルピーと溶解のエントロピーをそれぞれの晶系について評価した。また、イオン強度を変数として溶解のエンタルピーとエントロピーを評価した。
2.日本側は、成長した卵白リゾチーム結晶の内部の屈折率を二光束干渉法を使って測定する手段を確立した。この方法を使い、結晶に取り込まれた不純物と屈折率の相関を明らかにした。
3.日本側は、米国側の示唆・指導のもとに、高純度の卵白リゾチームを液体クロマトグラフィにより精製し、高純度試料を得た。これを使って原子間力顕微鏡で結晶の成長界面の観察を行った。その結果、高純度溶液で成長する結晶界面は、分子レベルでスムーズであるのに対して、従来高純度として市販されている試料を使って成長させた界面が、ラフであることが分かった。この結果を、米国側で得られている結晶中に生じるセクターバウンダリ-と不純物についての知見やX線トポグラフィの結果と比較し、議論を行った。精密なタンパク質の構造決定を組んでいるのは、結晶のモザイク性のために結晶の完全性が損なわれるためであると言われている。今回の結果から、モザイク性の出現機構を明らかにし、完全性の高いタンパク質結晶を得る指針を示すことができた。
4.日本側は10Tの強磁場中で卵白リゾチーム結晶の成長実験を行った。その結果、磁場により、核形成頻度と出現する結晶の配向が制御できることが明らかになった。この磁場の効果の起源についてタンパク質分子の構造と磁気的性質を踏まえて米国側と議論した。
5.米国側は、アポフェリチンの精製を行い、これを結晶化させた。その結果、成長する結晶核の数が減り、それぞれの結晶のサイズが大きくなり、不純物の除去がタンパク質結晶の育成に不可欠であることが再確認された。一方、日本側は、フェリチンの高純度精製・結晶化を行い、フェリチン結晶の形態相図を作製した。その結果、結晶化の駆動力を強くするに従い、結晶形状に多面体晶→髄晶→樹枝状結晶の変化が見られた。
6.米国側は光散乱法によりタンパク質の凝集過程について考察を行い、溶液内での第二ビリアル係数を評価した。この結果をもとに、溶液内のイオン強度と分子間相互作用の関係を議論した。
7.米国側は、レーザー干渉法を用いて卵白リゾチーム結晶の表面に形成される成長丘の形状の経時変化を精密に測定し、成長速度と微斜面の傾きの時間変化を調べた。これらの量のゆらぎには相関があり、ゆらぎの振幅が適当なタンパク質濃度で強調されることがわかった。また、結晶の成長とともに、微斜面の傾きに自発的なリズムがあらわれ、これがステップ束の形成に結びついていることが明らかになった。このリズムの解釈については、結晶界面での成長カイネティックスと溶液内での分子の輸送過程との結合による非線形現象ではないかと考えている。
8.米国側は卵白リゾチーム結晶を育成する際、適当なタンパク質濃度と温度領域で、溶液相が二相に分離することを発見し、光散乱法によりこの相図を作製し、熱力学的議論を行った。二相分離した溶液の高濃度部分では、準安定なゲル相が生じ、ここからリゾチームの結晶が晶出するのが観察された。この相図での臨界点は、塩濃度とともに直線的に増加していた。
9.日本側は、二光束干渉法を用いて成長中の卵白リゾチーム結晶のまわりの濃度分布の計測を行ってきた。その解析の際、薄い溶液層で結晶を成長させるために、溶液内対流は、無視できるものと仮定していた。米国側は、この仮定を確かめるため、溶液の厚みと結晶のまわりの濃度分布の関係について計算機実験を行った。日本側は、米国側の結果と対比させるため、数種類の厚みのセルを作製して、その中で成長するリゾチーム結晶のまわりの濃度分布を計測した。日本側は、この結果をもとに、対流が抑えられる微小重力実験(落下棟実験)を来年度に行う計画である。
日本側は卵白リゾチームの結晶成長におよぼす圧力の効果を明らかにするために、高圧セル中でのタンパク質濃度のその場測定を行うとともに、成長速度の圧力依存性を調べた。その結果、圧力は溶解度を変化させるとともに、成長のカイネティックスにも影響をおよぼすことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] K.Kurihara,S.Miyashita,G.Sazaki,T.Nakada,Y.Suzuki and H.Komatsu: "Interferometric study on crystal growth of tetragonal lysozyme crystal." Journal of Crystal Growth. 166. 904-908 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] G.Sazaki,K.Kurihara,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "A novel approach to the solubility measurement of protein crystals by two-beam interferometry." Journal of Crystal Growth. 169. 355-360 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 佐崎 元、栗原和男、宮下 哲、小松 啓、中田俊隆: "二光束干渉法によるリゾチーム結晶周囲の濃度場観察" 日本結晶成長学会誌. 23. 413-421 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] G.Sazaki,E.Yoshida,H.Komatsu,T.Nakada,S.Miyashita and K.Watanabe: "Effects of a magnetic field on the nucleation and growth of protein crystals" Journal of Crystal Growth. (印刷中).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] E.Kashimoto,G.Sazaki,K.Hasegawa,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "Study on the crystallization of concanavalin A" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] E.Yoshida,G.Sazaki,T.Nakada,S.Miyashita,H.Komatsu and N.Niimura: "Morphodrom of ferritin crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Sakuma,S.Miyashita,G.Sazaki,T.Nakada and H.Komatsu: "Motion of macro-steps induced on the surface of a lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.Nakada,G.Sazaki,S.Miyashita and H.Komatsu: "In situ observation of growing surface of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] S.Yanagiya,G.Sazaki,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "Effect of a magnetic field on the orientation of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] S.Yanagiya,G.Sazaki,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "Effect of a magnetic field on the nucleation of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] B.R.Thomas,P.G.Vekilov and F.Rosenberger: "Heterogeneity determination and purification of commercial hen egg white lysozyme." Acta Cryst.D52. 776-784 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] P.Vekilov,L.A.Monaco,B.R.Thomas,V.Stojanoff and F.Rosenberger: "Repartitioning of NaCl and protein impurities in lysozyme crystallization." Acta Cryst.D52. 785-798 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] F.Rosenberger: "Protein crystallization" J.Crystal Growth. 166. 40-54 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Muschol and F.Rosenberger: "Lack of evidence for prenucleation aggregate formation in lysozyme crystal growth solutions." J.Crystal Growth. 167. 738-747 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] F.Rosenberger,P.G.Vekilov,M.Muschol and B.R.Thomas: "Nucleation and crystallization of globular proteins-what do we know and what is missing?" J.Crystal Growth. 168. 1-27 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] P.G.Vekilov,J.I.D.Alexander and F.Rosenberger: "Nonliner response of layer growth dynamics in the mixed kinetics-bulk transport regime." Phys.Rev.E.54. 6650-6660 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] P.G.Vekilov,H.Lin and F.Rosenberger: "Unsteady crystal growth due to step-bunch cascading." Phys.Rev.E.55. 3202-3214 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Muschol and F.Rosenberger: "Liquid-liquid phase separation in supersaturated lysozyme solutions : Coupling to precipitate formation and crystallization." Biophys.J.(accepted).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] F.Rosenberger,P.G.Vekilov,H.Lin and J.I.D.Alexander: "A rationale for system-dependent advantages and disadvantates of solution crystal growth at low gravity." Microgravity Sci.Technol.(accepted).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] H.Komatsu,S.Miyashita,T.Nakada,G.Sazaki and A.A.Chernov: ""An atomic level analysis of crystal growth mechanism in complex systems by means of nano-optical microscopy and AFM" in Advances in crystal growth mechanisms" Elsevier,Amsterdam, (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Kurihara, S.Miyashita, G.Sazaki, T.Nakada, Y.Suzuki and H.Komatsu: "Interferometric study on crystal growth o tetragonal lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. 166. 904-908 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] G.Sazaki, K.Kurihara, T.Nakada, S.Miyashita and H.Komatsu: "A novel approach to the solubility measurement of protein crystals by two-beam interferometry." Journal of Crystal Growth. 169. 355-360 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] G.Sazaki, K.Kurihara, S.Miyashu, H.Komatsu and T.Nakada: "In situ Observation of the Concentration Distribution around a Lysozyme Crystal by Two-beam Interferometry" Journal. of the Japanese.Association.for Crystal Growth.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] G.Sazaki, E.Yoshida, H.Komatsu, T.Nakada, S.Miyashita and K.Watanabe: "Effects of a magnetic field on the nucleation and growth of protein crystals" Journal of Crystal Growth. (in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] E.Kashimoto, G.Sazaki, K.Hasegawa, T.Nakada, S.Miyashita and H.Komatsu: "Study on the crystallization of concanavalin A" Journal of Crystal Growth. (In preparation).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] E.Yoshida, G.Sazaki, T.Nakada, S.Miyashita, H.Komatsu and N.Niimura: "Morphodrom of ferritin" Journal of Crystal Growth. (In preparation).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K.Sakuma, S.Miyashita, G.Sazaki, T.Nakada and H.Komatsu: "Motion o macro-steps induced on the surface of a lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (In preparation).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] T.Nakada, G.Sazaki, S.Miyashita and H.Komatsu: "In situ observation of growing surface of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (In preparation).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] S.Yanagiya, G.Sazaki, T.Nakada, S.Miyashita and H.Komatsu: "Effect of a magnetic field on the orientation of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (In preparation).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] S.Yanagiya, G.Sazaki, T.Nakada, S.Miyashita and H.Komatsu: "Effect of a magnetic field on the nucleation of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (In preparation).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] B.R.Thomas, P.G.Vekilov and F.Rosenberger: "Heterogeneity determination and purification of commercial hen egg white lysozyme." Acta Cryst.D52. 776-784 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] P.Vekilov, L.A.Monaco, B.R.Thomas, V.Stajanoff and F.Rosenberger: "Repartitioning of NaCl and protein impurities in lysozyme crystallization." Acta Cryst.D52. 785-798 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] F.Rosenberger: "Protein crystallization" J.Crystal Growth. 166. 40-54 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M.Muschol and F.Rosenberger: "Lack of evidence for prenucleation aggregate formation in lysozyme crystal growth solutions." J.Crysal Growth. 167. 738-747 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] F.Rosenberger, P.G.Vekilov, M.Muschol and B.R.Thomas: "Nucleation and crystallization of globular proteins-what do we know and what is missing?" J.Crystal Growth. 168. 1-27 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] P.G.Vekilov, J.I.D.Alexander and F.Rosenberger: "Nonlinear response of layr growth dynamics in the mixed kinetics-bulk transport regime." Phys.Rev.E.54. 6650-6660 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] P.G.Vekilov, H.Lin and F.Rosenberger: "Unsteady crystal growht due to step-bunch cascadig." Phys.Rev.E.55. 3202-3214 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M.Muschol and F.Rosenberger: "Liquid-liquid phase separation in supersaturated lysozyme solutions : Coupling to precipitate formation and crystallization." Biophys.J.(accepted).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] F.Rosenberger, P.G.Vekilov, H.Lin and J.I.D Alexander: "A rationale for system-dependent advantages and disadvantates of solution crystal growth at low gravity." Microgravity Sci.Technol.(accepted).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] H.Komatsu, S.Miyashita, T.Nakada, G.Sazaki and A.A.Chernov: Elsevier, Amsterdam. "An atomic level analysis of crystal growth mechanism in complex systems by means of nano-optical microscopy and AFM" in advances in crystal growth mechanisms, (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K.Kurihara,S.Miyashita,G.Sazaki,T.Nakada,Y.Suzuki and H.Komatsu: "Interferometric study on crystal growth of tetragonal lysozyme crystal." Journal of Crystal Growth. 166. 904-908 (1996)
• [文献書誌] G.Sazaki,K.Kurihara,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "A novel approach to the solubility measurement of protein crystals by two-beam interferometry." Journal of Crystal Growth. 169. 355-360 (1996)
• [文献書誌] 佐崎元、栗原和男、宮下哲、小松啓、中田俊隆: "二光束干渉法によるリゾチーム結晶周囲の濃度場観察" 日本結晶成長学会誌. 23. 413-421 (1996)
• [文献書誌] G.Sazaki,H.Yoshida,H.Komatsu,T.Nakada,S.Miyashita and K.Watanabe: "Effects of a magnetic field on the nucleation and growth of protein crystals" Journal of Crystal Growth. (印刷中).
• [文献書誌] E.Kashimoto,G.Sazaki,K.Hasegawa,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "Study on the crystallization of concanavalin A" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] E.Yoshida,G.Sazaki,T.Nakada,S.Miyashita,H.Komatsu and N.Miimura: "Morphodrom of ferritin crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] K.Sakuma,S.Miyashita,G.Sazaki,T.Nakada and H.Komatsu: "Motion of macro-steps induced on the surface of a lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] T.Nakada,G.Sazaki,S.Miyashita and H.Komatsu: "In situ observation of growing surface of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] A.Yanagiya,G.Sazaki,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "Effect of a magnetic field on the orientation of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] S.Yanagiya,G.Sazaki,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "Effect of a magnetic field on the nucleation of lysozyme crystal" Journal of Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] B.R.Thomas,P.G.Vekilov and F.Rosenberger: "Heterogeneity determination and purification of commercial hen egg white lysozyme." Acta Cryst.D52. 776-784 (1996)
• [文献書誌] P.Vekilov,L.A.Monaco,B.R.Thomas,V.Stojanoff and F.Rosenberger: "Repartitioning of NaCl and protein impurities in lysozyme crystallization." Acta Cryst.D52. 785-798 (1996)
• [文献書誌] F.Rosenberger: "Protein crystallization" J. Crystal Growth. 166. 40-54 (1996)
• [文献書誌] M.Muschol and F.Rosenberger: "Lack of evidence for prenucleation aggregate formation in lysozyme crystal growth solutions." J. Crystal Growth. 167. 738-747 (1996)
• [文献書誌] F.Rosenberger,P.G.Vekilov,M.Muschol and B.R.Thomas: "Nucleation and crystallization of globular proteins-what do we know and what is missing?" J. Crystal Growth. 168. 1-27 (1996)
• [文献書誌] P.G.Vekilov,J.I.D.Alexander and F.Rosenberger: "Nonlinear response of layer growth dynamics in the mixed kinetics-bulk transport regime." Phys. Rev. E.54. 6650-6660 (1996)
• [文献書誌] P.G.Vekilov,H.Lin and F.Rosenberger: "Unsteady crystal growth due to step-bunch cascading." Phys. Rev. E.55. 3202-3214 (1997)
• [文献書誌] M.Muschol and F.Rosenberger: "Liquid-liquid phase separation in supersaturated lysozyme solutions : Coupling to precipitate formation and crystallization." Biophys. J.(accepted).
• [文献書誌] F.Rosenberger,P.G.Vekilov,H.Lin and J.I.D.Alexander: "A rationale for system-dependent advantages and disadvantates of solution crystal growth at low gravity." Microgravity Sci. Technol.(accepted).
• [文献書誌] H.Komatsu,S.Miyashita,T.Nakada,G.Sazaki and A.A.Chernov: ""An atomic level analysis of crystal growth mechanism in complex systems by means of nano-optical microscopy and AFM" in Advances in crystal growth mechanisms" Elsevier,Amsterdam, (1997)
• [文献書誌] T.Nakada,S.Miyashita,G.Sazaki,H.Komatsu and A.A.Chernov: "Atomic force microscopic study of subsurface ordering and structural transforms in n-alcohol on mica and graphite" Jpn. J. Appl. Phys.35. L52-L55 (1996)
• [文献書誌] K.Kurihara,S.Miyashita,G.Sazaki,T.Nakada,Y.Suzuki and H.Komatsu: "Interferometric study on crystal growth of tetragonal lysozyme crystal." J. Crystal Growth. (印刷中).
• [文献書誌] Gen Sazaki,K.Kurihara,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "A novel approach to the solubility measurement of protein crystals by two-beam interferometry" J. Crystal Growth. (投稿中).
• [文献書誌] E.Kashimoto,G.Sazaki,T.Nakada,S.Miyashita and H.Komatsu: "Stydy on the crystallization of concanavalin A" J. Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] K.Sakuma,S.Miyashita,G.Sazaki,T.Nakada and H.Komatsu: "Motion of macro-steps induced on the surface of a lysozyme crystal" J. Crystal Growth. (発表予定).
• [文献書誌] P.G.Vekilov,M.Ataka,and T.Katsura: "Growth processes of protein crystals revealed by laser Michelson interferometry investigation" Acta Crystallographica D. 51. 207-219 (1995)
• [文献書誌] Martin Muschol and Franz Rosenberger: "Interactions in under-and supersaturated lysozyme solutions-static and dynamic light scattering results" J. Chem. Phys.
• [文献書誌] A.A.Chernov and H.Komatsu,(eds.J.P.van der Eerden and O.S.L.Bruinsma): "“Topics in Crystal Grwoth Kinetics."in “Science and Technology of Crystal Growth"" Kluwer Academic Publishers, 14 (1995)
• [文献書誌] A.A.Chernov and H.Komatsu,(eds.J.P.van der Eerden and O.S.L.Bruinsma): "“Principles of crystal growth in protein crystallization."in “Science and Technology of Crystal Growth"" Kluwer Academic Publishers, 25 (1995)