蛋白質の立体構造形成反応の分子機構に関する共同研究

• 研究課題/領域番号: 07044200
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 後藤 祐児 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (40153770)
• 研究分担者: 瀬川 新一 関西学院大学, 理学部, 教授 (70103132) ; 桑島 邦博 東京大学, 大学院・理学系, 助教授 (70091444) ; 河田 康志 鳥取大学, 工学部, 助教授 (40177697) ; 片岡 幹雄 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (30150254) ; CHAN Hue Sun カリフォルニア大学, 薬学部, 助教授 ; FINK A.L. カリフォルニア大学, 化学生化学部, 教授 ; DOBSON C.M. オックスフォード大学, 化学部, 教授 ; DILL Ken A カリフォルニア大学, 薬学部, 教授 ; KIM P.S. マサチューセッツ工科大学, 生物部, 教授 ; DOBSON Chris M University of Oxford ; FINK Anthony L University of California, Santa Cruz ; KIM Peter S Massachusetts Institute of Technology ; DILL Ken A. カリフォルニア大学, 薬学部, 教授
• 研究期間 (年度): 1995 – 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 4,600千円 (直接経費: 4,600千円); 1996年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円); 1995年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
• キーワード: 蛋白質 / 変性 / フォールディング反応 / X線溶液散乱 / 分子シャペロン / モルテン・グロビュール / 円二色性 / βラクトグロブリン

研究概要

蛋白質の立体構造形成の機構を明らかにすることは、蛋白質の構造や機能を理解する上で最も基本的かつ重要な課題である。更に最近では、蛋白質の機能自体、あるいは病気(例えばプリオン病)が蛋白質のフォールディングに密接に関連した例も明らかとなってきており、その重要性は一層高まっている。本研究では、同問題に関して独創的な研究を展開しているKim教授を中心として、さらに数名の著名な国外研究分担者を加え、多面的かつ相捕的な共同研究を実施した。各自が独自の手法で研究を行なうと共に、相互訪問して共同実験や討論を行った。更に、国内外の学会などを通じて積極的に交流した。次の成果を得た。
1.モルテン・グロビュール(MG)状態はコンパクトで多くの二次構造を含む中間的構造であり、構造形成反応の主要な中間状態と考えられている。しかし、詳細は明らかではない。MG状態の構造安定性とその役割は、研究分担者の共通の課題である。X線溶液散乱や、核磁気共鳴、熱測定をはじめとするさまざまな物理化学的手法を用いて、MG状態の構造と安定化機構や、構造形成反応における役割を研究した。その結果、現在、MGと呼ばれる構造は3種類に分類できることを示した。すなわち、1)シトクロムcに代表されるMGでは、分子の慣性半径は30%程度も増加しているが、全体としては球状である。2)アポミオグロビンに代表されるMGは、規則的な構造をとるコアの領域と、よりほどけた領域の2つから構成される。3)αラクトアルブミンに代表されるMGでは、ジスルフィド結合によって分子の慣性半径はネイティブ構造に比べて10%程度しか増加しておらず、球状性も保たれている。いずれのタイプのMGにおいても、疎水的相互作用が構造安定化に重要であるが、その程度はさまざまであり、ネイティブ構造に比べると弱い。これらの結果から、従来、MGとしてまとめて取り扱われていたものの実態は、最初に提案されたMGの定義とかなり異なるだけでなく、お互いにも、相当に多様であることが明らかとなった。
2.βラクトグロブリンは、ネイティブ構造が主にβシートからなるにもかかわらず、αヘリックス形成傾向の強い蛋白質である。すなわち、蛋白質の立体構造の安定化には、局所的相互作用と、非局所的相互作用が働くが、βラクトグロブリンは、両者の二次構造傾向が大きく異なる興味深い例である。遠紫外領域ストップトフローCDを用いて、βラクトグロブリンのフォールディング反応を調べた。その結果、フォールディング反応の途中に、ネイティブ構造には存在しないαヘリックスを含む中間体が過渡的に蓄積することを示した。更に、変性平衡実験を行い、速度論的実験で観測されたαヘリックス中間体が、平衡論的にも蓄積することを示した。これらより、フォールディングの途中で、まず、局所的相互作用によってαヘリックス中間体が形成され、最終的には非局所的な相互作用によってβシート構造が安定化される、「非階層的構造形成反応」の存在することを提唱した。βラクトグロブリンで見られたαヘリックスからβシートへの転移と同様な現象が、プラズミノゲン活性化因子インヒビターやプリオン蛋白質などでも見つかっている。βラクトグロブリンのフォールディング機構の詳細を明らかにすることは、より一般的な構造形成原理を理解する上で重要を考えて、現在も継続して研究を行っている。
3.分子シャペロンの作用機構を明らかにすることは、現在、蛋白質のフォールディング反応研究の重要な課題となっている。シトクロムcいくつかの構造状態を基質として、大腸菌の分子シャペロンGroELの基質認識機構を研究した。その結果、GroELは、基質蛋白質に存在する「水に露出した疎水性基クラスター」を認識して結合することを示した。また、疎水的相互作用が結合の駆動力であるが、静電的相互作用によって大きく影響されることを示した。更に、このような結合様式が、リン脂質膜と蛋白質との相互作用に類似していることを提案した。

研究成果

• [文献書誌] Kataoka,Mikio: "X-ray solution scattering studies of protein folding" Folding & Design. 1. R107-R114 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kataoka,Mikio: "Structural characterization of molten globule of α-lactalbumin by solution X-ray scattering" Protein Sci.6. 422-430 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hoshino,Masaru: "Interaction of GroEL with conformational state of horse cytochrome c" J.Mol.Biol.262. 575-587 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hirota,Nami: "Cooperative α-helix formation of β-lactoglobulin and melittin induced by hexafluoroisopropanol" Protein Sci.6. 416-421 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "Non-native α-helical intermediate in the refolding of β-lactoglobulin,a predominantly β-sheet protein" Nature Struct.Biol.3. 868-873 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Semisotnov,G.V.: "Protein globularization during folding. A study by synchrotron small-angle X-ray scattering" J.Mol.Biol.262. 559-574 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "Role of heme axial ligands in the conformational stability of the native and molten globule states of horse cytochrome c." J.Mol.Biol.256. 172-186 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "High helical propensity of the peptide fragments derived from beta-lactoglobulin,a predominantly beta-sheet protein." J.Mol.Biol.254. 737-746 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nishii,ichiro: "Thermodynamic stability of the molten globule states of apomyoglobin" J.Mol.Biol.250. 223-238 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shiraki,Kentaro: "Trifluoroethanol-iduced stabilization of the alpha-helical structure of beta-lactoglobulin." J.Mol.Biol.245. 180-194 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kataoka,Mikio: "Structural characterization of the molten globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering." J.Mol.Biol.249. 215-228 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kawata,Yasushi: "The role of ATP hydrolysis in the function of the chaperonin GroEL-Dynamic complex formation with GroES." FEBS Letters. 369. 283-286 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kawajima,Kunihiro: "The molten globule state of alpha-lactalbumin." FASEB J.10. 102-109 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Peng,Zheng-yu: "Local structural preferences in the alpha-lactalbumin molten globule." Biochemistry. 34. 3248-3252 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Dill,Ken A.: "Principles of protein folding-A perspective from simple exact models." Protein Science. 4. 561-602 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Balbach,Jochen: "Following protein folding in real time using NMR spectroscopy." Nature Struc.Biol.2. 865-870 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shi,Lee: "Conformational characterization of DnaK and its complexes with substrate protein by small-angle X-ray scattering." Biochemistry. 35. 3297-3308 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "Salt-induced formation of the molten globule state of apomyoglobin studied by isothermal titration calorimetry." Thermochimica Acta. 266. 385-400 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kataoka, Mikio: "X-ray solution scattering studies of protein folding" Folding & Design. 1. R107-R114 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kataoka, Mikio: "Structural characterization of molten globule of alpha-lactalbumin by solution X-ray scattering" Protein Sci.6. 422-430 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hoshino, Masaru: "Interaction of GroEL with conformational state of horse cytochrome c" J.Mol.Biol. 262. 575-587 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hirota, Nami: "Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin and melittin induced by hexafluoroisopropanol" Protein Sci.6. 416-421 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hamada, Daizo: "Non-native alpha-helical intermediate in the refolding of beta-lactoglobulin, a predominantly beta-sheet protein" Nature Struct.Biol.3. 868-873 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Semisotnov, G.V.: "Protein globularization during folding. A study by synchrotron small-angle X-ray scattering" J.Mol.Biol.262. 559-574 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hamada, Daizo: "Role of heme axial ligands in the conformational stability of the native and molten globule states of horse cytochrome c" J.Mol.Biol.256. 172-186 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hamada, Daizo: "High helical propensity of the peptide fragments derived from beta-lactoglobulin, a predominantly beta-sheet protein" J.Mol.Biol.254. 737-746 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nishii, Ichiro: "Thermodynamic stability of the molten globule states of apomyoglobin" J.Mol.Biol.250. 223-238 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Shiraki, Kentaro: "Trifluoroethanol-induced stabilization of the alpha-helical structure of beta-lactoglobulin" J.Mol.Biol.245. 180-194 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kataoka, Mikio: "Structural characterization of the molten globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering" J.Mol.Biol.249. 215-228 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kawata, Yasushi: "The role of ATP hydrolysis in the function of the chaperonin GroEL-Dynamic complex formation with GroES" FEBS Letters. 369. 283-286 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kuwajima, Kunihiro: "The molten globule state of alpha-lactalbumin" FASEB J.10. 102-109 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Peng, Zheng-yu: "Local structural preferences in the alpha-lactalbumin molten globule" Biochemistry. 34. 3248-3252 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Dill, Ken A.: "Principles of protein folding-A perspective from simple exact models" Protein Sci.4. 561-602 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Balbach, Jochen: "Following protein folding in real time using NMR spectroscopy" Nature Struct.Biol.2. 865-870 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Shi, Lee: "Conformational characterization of DnaK and its complexes with substrate protein by small-angle X-ray scattering" Biochemistry. 35. 3297-3308 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hamada, Daizo: "Salt-induced formation of the molten globule state of apomyoglobin studied by isothermal titration calorimetry" Thermochimica Acta. 266. 385-400 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kataoka,Mikio: "X-ray solution scattering studies of protein folding" Folding & Design. 1. R107-R114 (1996)
• [文献書誌] Kataoka,Mikio: "Structureal characterization of molten globule of α-lactalbumin by solution X-ray scattering" Protein Sci.6. 422-430 (1997)
• [文献書誌] Hoshino,Masaru: "Interaction of GroEL with conformational state of horse cytochrome c" J.Mol.Biol.262. 575-587 (1996)
• [文献書誌] Hirota,Nami: "Cooperative α-helix formation of β-lactoglobulin and melittin induced by hexafluoroisopropanol" Protein Sci.6. 416-421 (1997)
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "Non-native α-helical intermediate in the refolding of β-lactoglobulin,a predominantly β-sheet protein" Nature Struct.Biol.3. 868-873 (1996)
• [文献書誌] Semisotnov,G.V.: "Protein globularization during folding.A study by synchrotron small-angle X-ray scattering" J.Mol.Biol.262. 559-574 (1196)
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "Role of heme axial ligands in the conformational stability of the native and molten globule states of horse cytochrome c." J.Mol.Biol.256. 172-186 (1996)
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "High helical propensity of the peptide fragments derived from beta-lactoglobulin,a predominantly beta-sheet protein." J.Mol.Biol.254. 737-746 (1995)
• [文献書誌] Nishii,Ichiro: "Thermodynamic stability of the molten qlobule states of apomyoglobin" J.Mol.Biol.250. 223-238 (1995)
• [文献書誌] Shiraki,Kentaro: "Trifluoroethanol-induced stabilization of the alpha-helical structure of beta-lactoglobulin." J.Mol.Biol.245. 180-194 (1995)
• [文献書誌] Kataoka,Mikio: "Structural characterization of the molten globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering." J.Mol.Biol.249. 215-228 (1995)
• [文献書誌] Kawata,Yasushi: "The role of ATP hydrolysis in the function of the chaperonin GroEL-Dynamic complex formation with GroES." FEBS Letters. 369. 283-286 (1995)
• [文献書誌] Kuwajima,Kunihiro: "The molten globule state of alphalactalbumin." FASEB J.(in press). (1996)
• [文献書誌] Peng,Zheng-yu: "Local structural preferences in the alpha-lactalbumin molten globule." Biochemistry. 34. 3248-3252 (1995)
• [文献書誌] Dill,Ken A.: "Principles of protein folding-A perspective from simple exact models." Protein Science. 4. 561-602 (1995)
• [文献書誌] Balbach,Jochen: "Following protein folding in real time using NMR spectroscopy." Nature Struc.Biol.2. 865-870 (1995)
• [文献書誌] Shi,Lee: "Conformational characterization of DnaK and its complexes with substrate protein by small-angle X-ray scattering." Biochemistry. (in press). (1996)
• [文献書誌] Hamada,Daizo: "Salt-induced formation of the molten globule state of apomyo-globin studied by isothermal titration calorimetry." Thermochimica Acta. 266. 385-400 (1995)