遺伝子組み換え型糖タンパク質連鎖の生理的意義

• 研究課題/領域番号: 07044263
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 谷口 直之 大阪大学, 医学部, 教授 (90002188)
• 研究分担者: CHOUVAEV Vla ナンシー第一大学, 医学部, 研究員 ; YAMAMOTO Hir シカゴ神経科学研究所, 主任研究員 ; DENNIS James トロント大学, 医学部, 教授 ; DEUTSCH Haro ウィスコンシン大学, 医学部, 名誉教授 ; ANDERSON Mar コーネル大学, 医学部, 助教授 ; SIEST Gerard ナンシー第1大学, 薬学生物部, 教授 ; SCHACHTER Ha トロント大学, 医学部, 教授 ; 井原 義人 大阪大学, 医学部, 助手 (70263241) ; 近藤 宇史 長崎大学, 医学部, 教授 (00158908) ; 藤井 順逸 大阪大学, 医学部, 助教授 (00222258)
• 研究期間 (年度): 1995 – 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 10,600千円 (直接経費: 10,600千円); 1996年度: 5,300千円 (直接経費: 5,300千円); 1995年度: 5,300千円 (直接経費: 5,300千円)
• キーワード: 糖尿病 / 血管平滑筋 / 糖化反応 / 部位特異的変異 / アポリポプロテインE / ヘパリン結合性EGF様増殖因子 / γ-グルタミルトランスペプチダーゼ / r-グルタミルトランスペプチダーゼ / 糖鎖遺伝子 / γ-glutamyl transpeptidase / 糖タンパク質 / 糖転移酵素 / アポプロテインE

研究概要

r-glutamyltranspeptidaseは生体内の酸化還元制御をおこなう中心物質であるグルタチオンの分解酵素であり、細胞膜に結合して存在する2型の膜タンパク質である。本酵素は、正常ラットの肝臓にはほとんど存在しないが、肝臓癌組織には多量に発現し、また、正常組織では、腎臓、脳などに多く存在する。この酵素の活性部位については不明な点が多く、本酵素の結晶解析が待たれる。本酵素を大量に発現させることがこの目的にかなうことから、まず、バキュロウイスル/昆虫細胞系での本酵素の発現系を確立した。本酵素は大小の2つのサブユニットからなり、その活性は小サブユニットにあることが知られていたが、具体的な活性部位に関与するアミノ酸は特定されていなかった。活性部位の同定を行うため、主として部位特異的改変により多数の変異体を作成した。その結果、小サブユニットのセリン残基が活性に必須であり、本酵素の特異的阻害剤であるアシビシンと堅く結合すること、この部位は広くほかの種属由来の本酵素にもこの活性部位が保存されていることを明らかにした。また、本酵素の触媒機構も明らかにした。これらの研究は、コ-ネル大学医学部、Alton Meister教授ならびにMary Anderson教授と共同研究として多くの成果をあげた。これらの研究は4編のJ.Biol.Chemおよび2編のProc.Natl.Acad.USAに掲載された。
一方、糖尿病状態では、高血糖のために、からだのなかのタンパク質のN-末端アミノ基やリジンのε-アミノ基がグルコースやフルクトースなどの還元糖と反応して、シッフ塩基を形成し、いわゆる糖化反応をうけて機能が変化することが知られており、我々はこれまで、銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼが糖化により、分子が断片化され、活性酸素を生成し、DNAの切断もおこすことを明らかにして来た。この非酵素的な糖化反応の研究について、ナンシー大学のSiest教授、Wellman教授、Vladimir研究員との共同研究を行いアルツハイマー病などでもっとも重要な危険因子であるアポリポタンパクEが糖尿病などの高血糖値でタンパク分子が糖化により修飾をうけ、ヘパリンとの結合活性が低下することを見いだした。また、この糖化部位を特定することにも成功し、実際の糖尿病患者でもこのようなアポリポプロテインEの糖化反応が著しく促進していることから、糖尿病における合併症の誘因として重要な役割を占めている可能性があると考えられた。また糖尿病など動脈硬化病変で、とくに平滑筋細胞の増殖因子として重要な役割をはたしていると考えられる増殖因子のうち、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)のもつ増殖活性をアポリポプロテインEが高めることをあきらかにした。さらに、糖尿病状態では、いわゆるbicarbony1化合物であるメチルグリオキサールや3-デオキシルルコソンなどが増加することがしられている。これらの化合物がいずれも血管平滑筋細胞で、HB-EGFを特異的に発現させることも明らかにした。この発現には、活性酸素の生成がかかわり、いわゆる酸化還元制御により調節されていることもあきらかになった。さらに、この発現のシグナル伝達にかかわるプロテインキナーゼの同定にも成功している。このように、アポリポプロテインEおよびヘパリン結合性EGF様増殖因子はいずれも類似の血管平滑筋細胞の増殖活性をもっていることが推測され、糖尿病の合併症の一つとしての動脈硬化性病変のみならず、動脈硬化そのものの成因にも重要な役割を果たしていると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Ikeda Y.: "Expression of an active glycosylated human γ-glutamyl transpeptidase mutant that lacks a membrane anchor domain." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92. 126-130 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Involvement of Ser-451 and Ser-452 in the catalysis of human γ-glutamyl transpeptidase." J.Biol.Chem.270. 22236-22241 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Human γ-glutamyl transpeptidase mutants involving conserved aspartate residues and the unique cysteine residue of the light subunit." J.Biol.Chem.270. 12471-12475 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Yoshimura: "Suppression of lung metastasis of B16 mouse melanoma by N-acetylglucosaminyltransferase III gene transfection." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92. 8754-8758 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] E.Miyoshi: "Transfection of N-acetylglucosaminyltransferase III gene suppresses expression of hepatitis B virus in a human hepatoma cell line,HB611." J.Biol.Chem.270. 28311-28315 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] E.Miyoshi: "TGFβ up-regulates expression of the N-acetylglucosaminyltransferase V gene in mouse melanoma cells." J.Biol.Chem.270. 6216-6220 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yoshimura M.: "Bisecting N-acetylglucosamine on K562 cells is suppressive to natural killer cytotoxicity and promotes spleen colonization" Cancer Res.56. 412-418 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yoshimura M.: "Aberrant glycosylation of E-cadherin enhances cell-cell binding to suppress metastasis" J.Biol.Chem.271. 13811-13815 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kang R.: "Transcriptional regulation of the N-acetyl glucosaminyltansferase V gene in human bile duct carcinoma cells (HuCC-T1) is mediated by Ets-1" J.Biol.Chem.271. 26706-26712 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Uozumi N.: "Purification and cDNA cloning of porcine brain GDP-L-fuc : N-acetyl-β-D-glucosaminide : α1-6fucosyltransferase" J.Biol.Chem.271. 27810-27817 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sultan A.S.: "Bisecting GlcNAc structures act as neagative sorting signals for cell surface glycoproteins in forskolin-treated rat hepatoma" J.Biol.Chem.272. 2866-2872 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ihara Y.: "Overexpression of N-acetylglucosaminyltrans ferase III disrupts the tyrosine phosphorylation of Trk with resultant signaling dysfunction in PC12 cells treated with nerve growth factor" J.Biol.Chem.272. (in press) (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Expression of an active glycosylated human gamma-glutamyl transpeptidase mutant that lacks a membrane anchor domain" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92. 126-130 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Involvement of Ser-451 and Ser-452 in the catalysis of human gamma-glutamyl transpeptidase" J.Biol.Chem.270. 22236-22241 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Human gamma-glutamyl transpeptidase mutants involving conserved aspartate residues and the unique cysteine residue of the light subunit" J.Biol.Chem.270. 12471-12475 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoshimura M.: "Suppression of lung metastasis of B16 mouse melanoma by N-acetylglucosaminyltransferase III gene transfection" Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 92. 8754-8758 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Miyoshi E.: "Transfection of, N-acetylglucosaminyltransferase III gene suppresses expressoion of hepatitis B virus in a human hepatoma cell line, HB611" J.Biol.Chem.270. 28311-28315 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Miyoshi E.: "Transforming growth factor beta up-regulates expression of the N-acetylglucosaminyltransferase V gene in mouse melanoma cells" J.Biol.Chem.270. 6216-6220 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoshimura M.: "Bisecting N-acetylglucosamine on K562 cells is suppressive to natural killer cytotoxicity and promotes spleen colonization" Cancer Res.56. 412-418 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoshimura M.: "Aberrant glycosylation of E-cadherin enhances cell-cell binding to suppress metastasis" J.Biol.Chem.271. 13811-13815 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Uozumi N.: "Purification and cDNA cloning of porcine brain GDP-L-fuc : N-acetyl-beta-D-glucosaminide : alpha1-6fucosyltransferase" J.Biol.Chem.271. 27810-27817 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kang R.: "Transcriptional ragulation of the N-acetylglucosaminyltransferase V gene in human bile duct carcinoma cells (HuCC-T1) is mediated bv Ets-1" J.Biol.Chem.271. 26706-26712 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sultan A.S.: "Bisecting GlcNAc structures act as neagative sorting signals for cell surface glycoproteins in forskolin-treated rat hepatoma" J.Biol.Chem.272. 2866-2872 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ihara Y.: "Overexpression of N-acetylglucosaminyltransferase III disrupts the tyrosine phosphorylation of Trk with resultant signaling dysfunction in PC12 cells treated with nerve growth factor" J.Biol.Chem.272 (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoshimura M.: "Bisecting N-acetylglucosamine on K562 cells is suppressive to natural killer cytotoxicity and promotes spleen coloization" Cancer Res.56. 412-418 (1996)
• [文献書誌] Yoshimura M.: "Aberrant glycosylation of E-cadherin enhances cell-cell binding to suppress metastasis" J.Biol.Chem.271. 13811-13815 (1996)
• [文献書誌] Kang R.: "Transcriptional regulation of the N-acetyl glucosaminyltansferase V gene in human bile duct carcinoma cells(HuCC-T1)is mediated by Ets-1" J.Biol.Chem.271. 26706-26712 (1996)
• [文献書誌] Uozumi N.: "Purification and cDNA cloning of porcine brain GDP-L-fuc:N-acetyl-β-D-glucosaminide:α1-6fucosyltransferase" J.Biol.Chem.271. 27810-27817 (1996)
• [文献書誌] Sultan A.S.: "Bisecting GlcNAc structures act as neagative sorting signals for cell surface glycoproteins in forskolin-treated rat hepatoma" J.Biol.Chem.272. 2866-2872 (1997)
• [文献書誌] Ihara Y.: "Overexpression of N-acetylglucosaminyltrans ferase III disrupts the tyrosine phosphorylation of Trk with resultant signaling dysfunction in PC12 cells treated with nerve growth factor" J.Biol.Chem.272. in press (1997)
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Expression of an active glycosylated human γ-glutamyl transpeptidase mutant that lacks a membrane anchor domain." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92. 126-130 (1995)
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Involvement of Ser-451 and Ser-452 in the catalysis of human γ-glutamyl transpeptidase." J.Biol.Chem.270. 22236-22241 (1995)
• [文献書誌] Ikeda Y.: "Human γ-glutamyl transpeptidase mutants involving conserved aspartate residues and the unique cysteine residue of the light subunit." J.Biol.Chem.270. 12471-12475 (1995)
• [文献書誌] M.Yoshimura: "Suppression of lung metastasis of B16 mouse melanoma by N-acetylglucosaminyltransferase III gene transfection." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92. 8754-8758 (1995)
• [文献書誌] E.Miyoshi: "Transfection of N-acetylglucosaminyltransferase III gene suppresses expression of hepatitis B virus in a human hepatoma cell line,HB611." J.Biol.Chem.270. 28311-28315 (1995)
• [文献書誌] E.Miyoshi: "TGFβ up-regulates expression of the N-acetylglucosaminyltransferase V gene in mouse melanoma cells." J.Biol.Chem.270. 6216-6220 (1995)