基底膜の生物学的機能

• 研究課題/領域番号: 07044268
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 二宮 善文 岡山大学, 医学部, 教授 (70126241)
• 研究分担者: オウ スーク・ポール ハーバード大学, 医学部, 研究員 ; ウオルマン マット ハーバード大学, 医学部, 研究員 ; アプラ スニール ハーバード大学, 医学部, 研究員 ; 百田 龍輔 岡山大学, 医学部, 助手 (80263557) ; 大橋 俊孝 岡山大学, 医学部, 助手 (50194262) ; オルセン ビヨン ハーバード大学, 医学部, 教授 ; APTA Suneel Harvard Medical School ; OLSEN Bjorn Harvard Medical School ; OH Suk Paul Harvard Medical School ; WARMAN Matt Harvard Medical School ; スーク ポール・オウ ハーバード大学, 医学部, 研究員 ; マット ウォルマン ハーバード大学, 医学部, 研究員 ; スニール アプラ ハーバード大学, 医学部, 研究員 ; ビヨン オルセン ハーバード大学, 医学部, 教授 ; マット ウオルマン ハーバード大学, 医学部, 研究員
• 研究期間 (年度): 1995 – 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円); 1996年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円); 1995年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
• キーワード: 遺伝子ライブラリー / モノクローン抗体 / ホモロガスリコンビネーション / コラーゲン遺伝子 / 形質変化 / ノックアウトマウス / 遺伝子ライブラリ / cDNAライブラリー / IV型コラーゲン

研究概要

1)マウスライブラリーからα6(IV)cDNAの重複クローンを得、マウスα6(IV)鎖ポリペプチドの全アミノ酸の一次構造を決定することが出来た。その結果、以前に我々が決定したヒトα6(IV)鎖ポリペプチドの全アミノ酸の一次構造と類似であることがわかった。
2)マウスα6(IV)ポリペプチドのアミノ酸配列より特異抗体を作成し、マウスにおいてもヒトと同じようなα6(IV)ポリペプチドの組織分布を示すかどうかについて検索したところ、基本的にはヒトの分布と類似していた。但し局所においては、例えば腎糸球体基底膜等では多少の分布の相違が観察された。また、他のα鎖との対照的な発現の違いは顕著であった。さらには、対となる遺伝子col4A1/col4a2 col4A3/col4a4 col4A5/col4a6については、いくつかの臓器を除けば、各々同調的な発現様式が観察された。
(3)α鎖特異的モノクローン抗体を用いた組織分布より、6α鎖が構成する分子種を推定することが出来た。その結果、α1(IV)とα2(IV)、α3(IV)とα4(IV)とα5(IV)、α5(IV)とα6(IV)、そしてα4(IV)のホモトリマ-の四種類の分子種が存在すると思われる。このことは、α鎖特異抗体を用いた二重染色によって、また、アルポート症候群などの遺伝性の疾患の症例を用いて染色することによって確かめることが出来た。
4)マウスα6(IV)遺伝子の解析を進めたところ、エクソン31の択一的スプライシングが起こっていることを突き止めた。現在この択一的スプライシングが組織特異的に生じている現象か否かを検証している。
5)ヒトのアルポート症候群に合併する食道下部平滑筋症の症例において、20kb足らずの大きな塩基配列の欠損が検証された。詳細にこの塩基配列の欠損部位を検索すると、COL4A5遺伝子のイントロン1の一部、エクソン1、COL4A5とCOL4A6両遺伝子の上流部分、COL4A6遺伝子エクソン1'、イントロン1'、エクソン1、イントロン1、エクソン2そしてイントロン2の一部が欠失していることが判明した。さらに、イントロン2には、食道下部の平滑筋細胞増殖に関連のある遺伝子の存在が示唆された。現在この平滑筋細胞増殖に関連のある遺伝子の存在を究明しつつある。
6)ノックアウトマウス作成のため、マウス遺伝子断片よりエクソン2を除き、変りにNeo^R遺伝子を挿入したコンストラクトを構築した。ホモロガスリコンビネーションによってコンストラクトの導入された幹細胞を選択した。このような幹細胞を胚盤胞に注入することによりキメラマウスを作成することが出来た。現在、ヘテロ接合体およびホモ接合体の形質変化の検索を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Sugihara K.: "Experimental Anti-GBM glomerular nephritis induced in rats by immunization with syhthetic peptides based on six a chains of human type IV collagen." J.Pathol.178. 352-358 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ljubimov A.V.: "Extracellular alterations in human corneas with bullous keratopathy." Invest.Ophthal mol.Vis.Sci.37. 997-1007 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Rauf S.: "Nephritogenicity and a-chain composition of NC1 fractions of type IV collagen from bovine renal basement membrane." Virchow Archiv. 428. 281-288 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hino S: "Absence of α6(IV) collagen in kidney and skin of X-linked Alport syndrome." Pediatric Nephrology. 10. 742-744 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ljubinov,A V: "Basement membrane abnormalities in human eye with diabetic retinopathy." J.Histochem.Cytochem.44. 1469-1479 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Megumi Kagawa: "Epitope-defined monoclonal antibodies against type-IV collagen for diagnosis of Alport's syndrome." Nephrology Dialysis Transplantation. (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 二宮善文: "細胞外マトリックス-臨床医学への応用-" メヂカルレビュー社, 519 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Glew R.H.and Ninomiya Y.: "Clinical Studies in Medical Biochemistry" Oxford University Press, 449 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sugihara K.: "Experimental Anti-GBM glomerular nephritis induced in rats by immunization with syhthetic peptides based on six a chains of human type IV collagen." J.Pathol.178. 352-358 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ljubimov A.V.: "Extracellular alterations in human corneas with bullous keratopathy." Invest.Ophthal mol.Vis.Sci.37. 997-1007 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Rauf S.: "Nephritogenicity and a-chain composition of NC1 fractions of type IV collagen from bovine renal basement membrane." Virchow Archiv. 428. 281-288 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hino S: "Absence of alpha6 (IV) collagen in kidney and skin of X-linked Alport syndrome." Pediatric Nephrology. 10. 742-744 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ljubinov A.V: "Basement membrane abnormalities in human eye with diabetic retinopathy." J.Histochem.Cytochem.44. 1469-1479 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Megumi Kagawa: "Epitope-defined monoclonal antibodies against type-IV collagen for diagnosis of Alport's syndrome." Nephrology Dialysis Transplantation. (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoshifumi Ninomiya: Medical Review Inc.Extracellular Matrix : Application to Clinical Medicine, 1-519 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Glew R.H.and Ninomiya Y.: Oxford University Press. Clinical Studies in Medical Biochemistry, 1-449 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sugihara K.: "Experimental Anti-GBM glomerular nephritis induced in rats by immunization with syhthetic peptides based on six a chains of human type IV collagen." J.Pathol. 178. 352-358 (1996)
• [文献書誌] Ljubimov A.V.: "Extracellular alterations in human corneas with bullous keratopathy." Invest.Ophthal mol.Vis.Sci.37. 997-1007 (1996)
• [文献書誌] Rauf S.: "Nephritogenicity and a-chain composition of NCl fractions of type IV collagen from bovine renal basement membrane." Virchow Archiv. 428. 281-288 (1996)
• [文献書誌] Hino S: "Absence of α6(IV) collagen in kidney and skin of X-linked Alport syndrome." Pediatric Nephrology. 10. 742-744 (1996)
• [文献書誌] Ljubinov,AV: "Basemenet membrane abnormalities in human eye with diabetic retinopathy." J.Histochem.Cytochem.44. 1469-1479 (1996)
• [文献書誌] Megumi Kagawa: "Epitope-defined monoclonal antibodies against type-IV collagen for diagnosis of Alport's syndrome." Nephrology Dialysis Transplantation. (in press). (1997)
• [文献書誌] 二宮善文: "細胞外マトリックス-臨床医学への応用" メヂカルレビュー社, 519 (1996)
• [文献書誌] Glew R.H.and Ninomiya Y.: "Clinical Studies in Medical Biochemistry" Oxford University Press, 449 (1997)
• [文献書誌] Sado Y.: "Establishment of epitope-defined monoclonal antibodies recognizing the six different a chains of human type IV collagen by the rat lymph node method." Histochemistry and Cell Biology. 104. 267-275 (1995)
• [文献書誌] Ninomiya Y.: "Differential expression of two basement membrane collagen genes,COL4A6 and COL4A5,demonstrated by immunofluorescence staining using peptide-specific monoclonal antibodies." J.Cell Biol.130. 1219-1229 (1995)
• [文献書誌] Oohashi T.: "Isolation and structure of genomic DNA encoding the human α6 (IV) collagen chain and comparison with other type IV collagen genes." J.Biol.Chem.270. 26863-26867 (1995)
• [文献書誌] Sugihara K.: "Experimental Anti-GBM glomerular nephritis induced in rats by immunization with syhthetic peptides based on six a chains of human type IV collagen." J.Pathol.178(in press). (1996)
• [文献書誌] Ljubimov A.V.: "Extracellular alterations in human corneas with bullous keratopathy." Invest.Ophthal mol.Vis.Sci.(in press). (1996)
• [文献書誌] 二宮善文: "新しい基底膜コラーゲンα(IV)鎖とその遺伝子発現" 生化学, 1301-1307 (1995)
• [文献書誌] Karl Tryggvason and Yoshifumi Ninomiya: "Alport Syndrome (Hereditary Nephritis) In Clinical Studies in Medical Biochemistry,Eds.by Glew R.H.and Ninomiya Y." Oxford University Press,New York (in press), (1996)