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YAC導入マウスを用いての発生遺伝子の同定

研究課題

研究課題/領域番号 07044282
研究種目

国際学術研究

配分区分補助金
応募区分共同研究
研究機関熊本大学

研究代表者

山村 研一  熊本大学, 医学部, 教授 (90115197)

研究分担者 BALLING Rudo  ドイツ哺乳類遺伝学研究所, 所長
今井 賢治  ドイツ哺乳類遺伝学研究所, 研究員
ARFZT Karen  テキサス大学, 動物学, 教授
要 匡  熊本大学, 医学部, 助手 (40264288)
阿部 訓也  熊本大学, 医学部, 助教授 (40240915)
KUNIYA Abe  ASSOCIATE PROFESSOR,KUMAMOTO UNIVERSITY,SCHOOL OF MEDICINE
ARTZT Karen  テキサス大学, 動物学, 教授
ARTZE Karen  テキサス大学, 動物学, 教授
研究期間 (年度) 1995 – 1996
研究課題ステータス 完了 (1996年度)
配分額 *注記
5,000千円 (直接経費: 5,000千円)
1996年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
1995年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
キーワードトランスジェニックマウス / YAC / BAC / 発生 / ポジショナルクローニング / 突然変異体 / 形態形成 / ゲノム解析 / 突然変異 / T / tコンプレックス
研究概要

本研究ではポジショナルクローニング法とトランスジェニックマウス技術を結びつけ、巨大ゲノムDNA導入によって突然変異を機能的にレスキューする手法を確立し、これを利用して突然変異責任遺伝子を同定、単離することを目的とする。対象とするのはマウス17番染色体のt-コンプレックスにマップされる発生致死変異であるt^<w5>変異、神経系機能に関するqk(quaking)変異、或いは9番染色体にマップされる体節・骨形成に関与するtail kinks(tk)変異である。にそこで今年度はYAC導入マウス作製の基本技術の確立を行った。
我々は、現在までそれぞれの遺伝子座に関してポジショナルクローニングの手法により、原因遺伝子に数百kbの範囲にまで迫ってきている。これらはいずれも劣性突然変異であり、変異原因遺伝子を含むと予想されるゲノムDNA導入によりレスキューが可能と考えられる。すなわち、遺伝子型としてはホモ接合体でも(導入DNAによって相補され)表現型が正常な固体が得られた場合、導入DNA中に原因遺伝子があると考えられる。そこで、平成7年度は主にYAC(酵母人工染色体)クローンを用い、これを導入したトランスジェニックマウス作製法の確立を行った。DNA調製としては、まずt^<w5>領域から得られた650kbのYACクローンをパルスフィールド電気泳動法によって分離し、YAC DNAを含むゲル断片を切り出し、ポリアミンを含むバッファー中で平衡化した。アガロースゲルを消化するためにアガラーゼで処理し、これを微量透析装置により濃縮しYAC DNA溶液を調製した。このDNA溶液を再度パルスフィールド電気泳動によって展開し、サザンブロットを作製し、このYACクローンに含まれるプローブとハイブリダイズした。その結果、650kbの単一バンドが認められ、以上の手法により巨大YAC DNAを損傷することなく単離されたことが確認された。このDNAをマウス受精卵に導入し、3系統のYAC導入トランスジェニックマウス、Y11,Y31,Y35を樹立した。Y11系統では〜420kb、Y31系統では〜270kb,Y35系統では〜380kbの長さのYAC DNAが導入されていること、さらにトランスジーンのゲノムへの組込み部位は全ての系統で一カ所であり、かつ17番染色体以外であることをFISHによって確認した。現在それらのマ … もっと見る ウスを変異マウスと交配しt^<w5>変異がレスキューされるかを検討している。
以上のようにYAC導入マウス作製の基本技術は確立されたが、YACクローン自体の持つ問題点も明らかになってきた。YACクローンはインサートサイズが他のクローニングシステムと比較して大きいという利点を持つが、酵母内での相同組換えによりキメラ形成や欠失などDNAの再構成がかなりの頻度で起こることが知られている。実際、我々の用いたYAC650kbの内、左右両端、計350kb程度はキメラ部分であった。このようなYACの性質から、正確なゲノムの物理地図を作るのは困難な場合があり、さらにYACレスキューを指標として原因遺伝子を同定しようとする場合、ポジティブな結果が得られればよいが、ネガティブな場合は結論がでないことになる。BAC(細菌人工染色体)は大腸菌内で複製し、150-300kb程度のインサートを持つ。したがってインサートサイズはYACより小さいがより安定に存在し、DNA再構成は殆どないことが知られている。我々はtw5、tkの領域においてこれまでYACによってカバーしていた部分をBACで取り直しコンティグを作製した。その結果、tk遺伝子座ではD9Mit9を中心とした約500kb、4種類のBACクローンでカバーされる領域に原因遺伝子が存在することを見出し、t^<w5>ではH-2KからD17Mit148までの約1000kbのゲノム領域に原因遺伝子があり、その大半の部分をBACによってクローニングした。さらに、tk領域のBACクローンを導入したトランスジェニックマウス作製を始めている。BACインサートの調製はYAC DNA調製に用いた方法を応用し、ラムダファージのタ-ミネース酵素で線状化し、マイクロインジェクション法にてマウス受精卵に導入した。その結果、これまで24匹のマウスが得られ、4匹にトランスジーンの組込みが認められた(うち2匹は出生時に死亡)。現在これから系統の樹立を行っており、また他のクローンに関してもDNA調製、トランスジェニックマウス作製を進めている。またqk変異に関しては候補遺伝子が発見されたが、遺伝子ターゲティングの方法で新たに変異マウスを作製、元々のqk変異マウスと交配させ、遺伝的相補性試験を行った結果、原因遺伝子であることを結論づけた。現在、この遺伝子を含むBACクローンを導入し、レスキューされるか否か検討している。 隠す

報告書

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  • [文献書誌] Kimura,S.et al.: "A 900 bp genomic region from the mouse dystrophin promoter directs lacZ reporter expression only to the right heart of transgenic mice." Dev.Growth Diff.(in press). (1997)

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  • [文献書誌] Abe,K.et al.: "Purification of primordial germ cells from TNAP^<β-geo> mouse embryos using FACS-gal." Develop.Biol.180. 468-472 (1996)

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  • [文献書誌] Abe,K.et al.: "Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies." Exptl.Cell Res.229. 27-34 (1996)

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  • [文献書誌] Ando,A.et al.: "cDNA cloning of the human homologues of the mouse Ke4 and Ke6 genes at the centromeric end of the human MHC region." Genomics. 35. 600-602 (1996)

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  • [文献書誌] Niwa,H.et al.: "Cell-cycle-dependent expression of the STK-1 gene encoding a novel murine putative protein kinase." Gene. 169. 197-201 (1996)

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  • [文献書誌] Nagata,T.et al.: "Physical mapping of the retinoid X receptor β in mouse and man." Immunogenetics. 41. 83-90 (1995)

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  • [文献書誌] Hiramatsu,R.et al.: "The 3'enhancer region determines the B/T specificity and pro-B/pre-B specificity of immunoglobulin Vk-Jk joining." Cell. 83. 1113-1123 (1995)

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  • [文献書誌] Kimura, S.: "A 900bp genomic region from the mouse dystrophin promoter directs lacZ reporter expression only to the right heart of transgenic mice." Dev.Growth Diff.(in press). (1997)

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  • [文献書誌] Abe, K.: "Purification primordial germ cells from TNAP^<beta-geo> mouse embryos by FACS-gal." Develop.Biol.180. 468-472 (1996)

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  • [文献書誌] Abe, K.: "Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies." Exptl.Cell Res.229. 27-34 (1996)

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  • [文献書誌] Ando, A.: "cDNA cloning of the human homologues of the mouse Ke4 and Ke6 genes at the centromeric end of the human MHC region." Genomics. 35. 600-602 (1996)

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  • [文献書誌] Niwa, H.: "Cell-cycle-dependent expression of the STK-1 gene encoding a novel murine putative protein kinase" Gene. 169. 197-201 (1996)

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  • [文献書誌] Nagata, T.: "Physical mapping of the retinoid X receptor beta in mouse and man." Immunogenetics. 41. 83-90 (1995)

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  • [文献書誌] Hiramatsu, R.: "The 3' enhancer region determines the B/T specificity and pro-B/pre-B specificity of immunoglobulin Vk-Jk joining" Cell. 83. 1113-1123 (1995)

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  • [文献書誌] Ando, A. et al. et al.: "cDNA cloning of the human homologues of the mouse Ke4 and Ke6 genes at the centromeric end of the human MHC region." Genomics. 35. 600-602 (1996)

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      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Niwa, H. et al.: "Cell-cycle-dependent expression of the STK-1 gene encoding a novel murine putative protein kinase." Gene. 169. 197-201 (1996)

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      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Nagata,Y.et al.: "A6-kb upstream region of the human transthyretin gene can direct developmental,tissue-specific,and quantitatively normal expression in transgennic mouse." J.Biochem.117. 169-175 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Kitamura,D.et al.: "Molecular cloning and characterization of mouse HS1." Biochem.Biophys.Res.Commun.208. 1137-1146 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Hashido,K.et al.: "Copy-dependent and position-independent expression of rat aldolase A gene." J.Biochem.118. 601-606 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Hiramatsu,R.et al.: "The 3' enhancer region determines the B/T specificity and pro-B/pro-B specificity of immunoglobulin Vκ-Jκ joining." Cell. 83. 1113-1123 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Nagata,T.et al.: "Physical mapping of the retinoid X receptor b in mouse and man." lmmunogenetics. 41. 83-90 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Kaname,T.et al.: "The expression of truncated MK in human tumors." Biochem.Biophys.Res.Commun.219. 256-260 (1996)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Oku,S.et al.: "Developmental mechanisms of heart disease" Futura Publishing company, 8 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書

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公開日: 1995-04-01   更新日: 2016-04-21  

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