G1/S移行におけるRB蛋白質の役割

• 研究課題/領域番号: 07254215
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 国立がんセンター
• 研究代表者: 田矢 洋一 国立がんセンター研究所, 生物学部, 室長 (60133641)
• 研究期間 (年度): 1995
• 研究課題ステータス: 完了 (1995年度)
• 配分額: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円); 1995年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
• キーワード: RB蛋白質 / 細胞周期 / サイクリンD1 / Cdk4 / Cdk2 / サイクリンE / サイクリンA / p107

研究概要

RB蛋白質の細胞増殖抑制活性は細胞周期特異的なリン酸化で制御されている。しかし、癌化のメカニズムを考える際に特に重要なGl/S移行期においては、サイクリンD、E、Aをそれぞれ含む少なくとも3種類以上のキナーゼがそのリン酸化に関与すると言われながらも、使い分けの機構などが不明であるので、それを解明することを目的とした。
そのために、サイクリンDl/Cdk4、サイクリンE/Cdk2とサイクリンA/Cdk2をそれぞれ精製し、これらの精製キナーゼで多くの種類の合成ペプチドや蛋白質のリン酸化を行い、基質特異性の違いを解析した。一方では、化学合成したリン酸化ペプチドを抗原として、RB蛋白質の特定リン酸化部位のみ認識するモノクローナル抗体の作製を試みた。
その結果、サイクリンEやA依存性キナーゼによるリン酸化の共通モチーフはS/T-P-X-K/Rであるが、サイクリンDl/Cdk4のそれは明確に異なり、-2の位置にProを必要とすることがわかった。さらに、RB蛋白質上にはサイクリンDl/Cdk4特異的なリン酸化部位があることを見い出し、その部位を変異させたRB蛋白質も作製した。また、p107がサイクリンDl/Cdk4でリン酸化されることもことも見い出した。一方では、RB蛋白質の807番目のリン酸化セリンを認識するモノクローナル抗体が作製できた。
Cdk4特異的なインヒビターであるp16は、多くの癌で失活している癌抑制遺伝子産物でもあるので、p16と同様な活性をもつ低分子物質は癌治療薬になると期待されるが、我々が発見したサイクリンDl/Cdk4の基質特異性は、そうした低分子物質の探索に利用できるはずである。

研究成果

• [文献書誌] Kitagawa, M. et al.: "Phosphorylation of E2F-1 by cyclin A-cdk2." Oncpgene. 10. 229-236 (1995)
• [文献書誌] Ueno, Y. et al.: "Chemical synthesis of phosphopeptides using arylthio group for protection of phosphate : Application to identification of cdc2 kinase-phosphorylation sites." Int. J. Peptide Prot. Res.46. 106-112 (1995)
• [文献書誌] Hiwasa, T. et al.: "Inhibition of cysteine proteinases and proteosome by Ras, Ran and cyclin." Proteases Involved in Cancer. 183-187 (1995)
• [文献書誌] Suzuki-Takashi, I. et al.: "The interaction of E2F with pRB and p107 are regulated via the phosphorylation of pRB and p107 by cyclin-dependent kinase." Oncogene. 10. 1691-1698 (1995)
• [文献書誌] Ueno, Y., et al.: "Solid-phase synthesis of peptides containing O-phosphoryl serine and O-phosphoryl threonine using allyl group for phosphate protection." Bioorg. Med. Chem. Let.5. 823-826 (1995)
• [文献書誌] Saijo, M. et al.: "Molecular cloning of a human protein that binds to the retinoblastoma protein and chromosomal mapping." Genomics. 27. 511-519 (1995)
• [文献書誌] Taya, Y.: "Cell cycle-dependent phosphorylation of the tumor suppressor RB protein." Molecules and Cells. 5. 191-195 (1995)
• [文献書誌] Inoue, A. et al.: "70-kDa heat shock cognate protein directly interacts with N-terminal region of the retinoblastoma gene product pRb-identification of a novel region of pRb mediating protein interaction." J. Biol. Chem.270. 22571-22576 (1995)
• [文献書誌] Sakai, Y. et al.: "cDNA sequence, chromosomal localization of a novel human protein RBQ-1 which binds to the retinoblastoma gene product." Genomics. 30. 98-101 (1995)
• [文献書誌] Higashi, H. et al.: "Differences in substrate specificity between Cdk2-cyclin A and Cdk2-cyclin E in vitro." Biochem. Biophys. Res. Commun.216. 520-525 (1995)
• [文献書誌] Higashi, H. et al.: "Cdk2 forms an inactive complex with cyclin D1 since Cdk2 associated with cyclin D1 is not phosphorylated by Cdk7-cyclin H." Eur. J. Biochem.(in press). (1996)
• [文献書誌] Kitagawa, M. et al: "The consensus motif for phosphorylation by cyclin D1-Cdk4 is different from that of phosphorylation by cyclin A/E-Cdk2." EMBO J.(in press).