温度感受性ヒトp53癌抑制遺伝子を用いた細胞増殖制御機構の解明

• 研究課題/領域番号: 07272215
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 土田 信夫 東京医科歯科大学, 医学部, 教授 (60089951)
• 研究期間 (年度): 1995
• 研究課題ステータス: 完了 (1995年度)
• 配分額: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円); 1995年度: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
• キーワード: 癌抑制遺伝子 / p53 / 温度感受性変異株 / G1停止 / アポトーシス / Rb

研究概要

p53癌抑制遺伝子の変異は殆ど全てのヒト癌で最も高頻度にみられる。我々は野生型p53のもつ細胞増殖機能に解析するために、ヒトp53の138番目をアラニンからバリンに変えた温度感受性変異株(vall38)を作成し、ラット初代線維芽細胞(REF)、ヒト骨肉腫細胞(Saos-2)、ヒトT細胞白血病(Jurkat)、およびヒト赤白血病細胞(K562)に導入した。これらの細胞を低温シフトしたときの細胞増殖に対する影響を、生細胞数、DNA含量等を基に解析したところ、Jurkat細胞はアポトーシスを他の細胞はG1停止をおこしていた。なおSaos-2細胞ではG2/M停止を起こすものもかなりあった。p53によるG1停止に関してはp21cipl(waf1)の発現誘導、cdk/cyclinの阻害、Rbの脱リン酸化、E2Fとの結合を介するDNA合成開始の阻害が考えられている。G1停止をおこす細胞でp53の下流のシグナル伝達をしらべたところ、K562細胞では上記と一致する。REF細胞ではp21cip1(waf1)の発現誘導を介さない、Rbの発現のないSaos-2細胞ではRbの代わりにp130がG1停止の、シグナル伝達に係わっていることが判明した。そこでREF、Saos-2細胞でのG1停止に、またJurkat細胞でのアポトーシスに関与する遺伝子をクローシングするため、低温シフト前と後それぞれ6時間サイクロヘキシミド存在下で培養し、mRNAを精製後cDNAライブラリーを作成した。低温シフト後に野生型活性によって発現誘導されると思われる新たな遺伝子の検索をピオチン/ストレプトアビジンによるサブトラクション法を用いて試みたが得ることが出来なかった。

研究成果

• [文献書誌] 1.Hirano,Y.,Yamato,K.,and Tsuchida,N.: "A tempertature sensitive mutant of the human p53, val138, arrest rat cell growth without induced expression of cip1/waf1/sdi1 after temperature shit-down." Oncogene. 10. 1879-1885 (1995)
• [文献書誌] 2.Yamato,K.,Yamanoto,M.,Hirano Y.,and Tsuchida,N.: "A human temprature-sensitive p53 mutatnt,p53val-138;Modulation of thecell cycle,viability and expression of p53-responsive genes." Oncogene. 11. 1-6 (1995)
• [文献書誌] 3.Hirano,Y.,Tsutsumi-Ishii,Y.,and Tsuchida,N.: "Roles of p53 mutation in cell line establihsment and identification of the minimum transactivation and transform suppression domains." Eur.J.Cancer. 32B. 129-135 (1995)
• [文献書誌] 4.Tsutsumi-Ishii,Y.,Tadokoro,K.,Hanaoka,F.,and Tsuchida,N.: "Response of heat shock element (HSE) within the human HSP70 promoter to mutated p53 genes." Cell Growth & Differ.6. 1-8 (1995)
• [文献書誌] 5.Munirajan,A.K.,Tsutsumi-Ishi,Y.,Mohanprasad,K.C.,Hirano,Y.,Munakata,N.,Shanmugam,G.,and Tsuchida,N.: "P53 gene mutations in oral carcinomas from lndia." Int.J.Cancer. (in press).
• [文献書誌] 6.Takada,S.,Tsuchida,N.,Kobayashi,M.and Koike,K.: "Disruption of the function of tumor-suppressor gene p53 by the hepatitis B virus X protein and hepatocarcinogenesis." J.Cancer Res.Clin.Oncol.,. (in press).
• [文献書誌] 7.Sekiguchi,T.,Nakashima T.,Hayashida,T.,Kuraoka,A.,Hashimoto,S.,Tsuchida,N.,Shibata,Y.,Hunter,T.,and Nishimoto,T.: "Apoptosis is induced in BHK cells by the tsBN462/13 mutation in the CCG1/TAFII250 subunit of the TFIID basal transcription factor." Exp.Cell.Res.,. 218. 161-164 (1995)
• [文献書誌] 8.Sugito,K.,Yamane,M.,Hattori,H.,Tohnai,I.,Ueda,M.,Tsuchida,N.,and Ohtsuka,K.: "Interaction between hsp70 and hsp40,eucaryotic homologues of DnaK and DnaJ,in human cells expressing mutant-type p53." FEBS Letters. 358. 161-164 (1995)