リゾチームの塩酸グアニジン変性構造の解析

• 研究課題/領域番号: 07280206
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 横浜国立大学
• 研究代表者: 藤原 敏道 横浜国立大学, 工学部, 助教授 (20242381)
• 研究期間 (年度): 1995
• 研究課題ステータス: 完了 (1995年度)
• 配分額: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円); 1995年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
• キーワード: 変性構造 / リゾチーム / 蛋白質安定性 / 塩酸グアニジン / H-D交換

研究概要

リゾチームについて円偏光二色性による研究から同じ変性状態でも温度変性とグアニジン変性では二次構造の存在が異なることが示唆されてる。一方、NMRによる研究より、熱変性状態の構造が完全なランダムコイルには至っていないことが示唆されている。そこで本研究ではNMRを用いて、卵白リゾチームの塩酸グアニジン変性と熱変性の比較を行った。
実験としては、さまざまなpHおよび塩酸グアニジン濃度で、温度を変えて重水溶液中のニワトリ卵白リゾチームの^1H-NMRスペクトルの測定した。実験の結果、(1)pDの変化による変性温度はpD0.99から3.25まで変性温度が徐々に上昇していくが、それ以上のpDでは中性まで変性温度はほとんど変化しなかった。(2)0.5Mから3.0M塩酸グアニジン濃度までは、変性温度が徐々に下降して行くが、それ以上の塩酸ジアニジン濃度では6.0Mまで変性温度は10℃以下であった。(3)変性剤が存在する時も存在しない時も、変性した後、芳香環プロトン領域のスペクトルは温度とともに変化した。これはタンパク質の変性構造が温度に依存しているためであると考えられる。(4)pD2.5,3.0M以上の塩酸グアニジン存在下、10から30℃においては、変性状態でも交換しにくいアミドプロトンが存在した。これはCDから結論されているランダム構造と矛盾する。(5)pD2.5、6.0塩酸グアニジン存在下10℃において、NMRの信号強度の時間依存性から、アミドプロトンのHD交換速度を調べた。その半減期は5時間で20時間までは指数関数的に減少するが、それ以降はほとんど減少せず60時間後までもシグナルは残った。現在、これらアミドプロトンの信号同定し、変性構造の解析を行っている。