| 研究課題/領域番号 |
07456149
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用分子細胞生物学
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
南森 隆司 神戸大学, 農学部, 助教授 (00180555)
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| 研究分担者 |
王子 善清 神戸大学, 農学部, 教授 (90031195)
深見 泰夫 神戸大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (00156746)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
1996年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1995年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | PROTEIN KINASE / PROTEIN KINASEC / AGC-PROTEIN KINASE / ELIGLENA GRACILUS / PROTISTA / MOLECULAR EVOLUTION / PROTEIN KINASE C / EUGLENA GRACILUS / SIGNAL TRANSDLICTION / EUGLENA |
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| 研究概要 |
細胞内情報伝達過程において蛋白質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ)は重要な役割を演じている。プロテインキナーゼは5つのグループに分類されるが、その中でも、主にセカンドメッセンジャーと呼ばれる分子を情報仲介役として必要とするAGCキナーゼグループは特に多種多様な機能、制御機構を持ち、生命の維持を司る主要なものであるといえる。哺乳類や酵母ではその構造、機能などの研究は進展しているが、植物や原生植物などにおいては未知の部分が多い。そこで本研究では、分類学上動物、植物の双方に位置する原生生物、Euglena gracilisを材料とし、AGCキナーゼファミリー遺伝子に注目し、進化の道筋をその根源的な形を有する生命体までさかのぼることによって、その原始的な存在状態を解析することを目的とした。
既知のプロテインキナーゼにおける相同性の高いアミノ酸配列領域に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド混合プライマーを用いて、対数増殖期にあるEuglena gracilisより抽出したmRNAを鋳型としてReverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)を行った。得られたPCR産物をサブクローニングし、その塩基配列を解析した。さらにcDNAライブラリーを作成し、^<32>PでラベルしたRT-PCRプローブを用いプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。陽性クローンからプラスミドを回収し、インサートDNAの塩基配列を解析した。
PT-PCRの結果、12種類の異なるPCR産物を得た(PK-1〜-12)。いずれもAGCキナーゼファミリーと最も高い相同性が認められた。その内PK-8を用いてcDNAライブラリーからのスクリーニングを行った結果、挿入断片がそれぞれ1.6、1.4、2.5、1.6kbpの大きさの4種類のキナーゼクローン(EPK-3、EPK-4、EPK-16、EPK-19)を得た。そのキナーゼ触媒ドメインの部分配列はPKC、PKA、RACなどのAGCキナーゼと部分的に高い相同性が認められた。またこれらEPK遺伝子群に既存のAGCキナーゼを加えクラスター分析を行った結果、AGCキナーゼはPKA、PKC、RAC等のそれぞれがクラスターを形成したが、EPK遺伝子群はAGCキナーゼグループに対してアウトグループを形成した。これらのことからEPK遺伝子群はAGCキナーゼの起源的な構造を持つ可能性があることが示唆された。
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