アデニル酸キナーゼの分子病態学的意義に関する研究

• 研究課題/領域番号: 07457098
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 衛生学
• 研究機関: 宮崎医科大学
• 研究代表者: 濱田 稔 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (90039529)
• 研究分担者: 上杉 晴一 横浜国立大学, 工学部, 教授 (70028851) ; 竹中 均 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (10179658)
• 研究期間 (年度): 1995 – 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 6,800千円 (直接経費: 6,800千円); 1996年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円); 1995年度: 5,400千円 (直接経費: 5,400千円)
• キーワード: アデニル酸キナーゼ / 部位特異的変異法 / タンパク質工学 / 基質酵素相互作用 / リジン残基 / キネティックス解析 / ヒトAK1 / pMEX8hAK1 / pMEX8-hAK1 / Adenylate Kinase / Mutagenesis / Protein engineering

研究概要

ヒト骨格筋細胞質局在のアデニル酸キナーゼ(AK1)は、筋細胞内アデニンヌクレオチドの平衡に関与し、種々の生物種に普偏的に存在するアイソザイムの一つである。本酵素の生理学的意義はクレアチンキナーゼとの協調によって細胞内のATP供給に深くかかわっているが、病態学的な意義としては、128番目のアルギニンがトリプトファンに変異することによって生じた溶血性貧血が知られているに過ぎない。しかし、細胞におけるATP産生その細胞の生死に密接に関与するだけに致命的な本酵素のDNAの変異は表現型として現れにくいことも考えられる。諸病態の分子論的解明に資する手がかりにとって基礎的な背景を探る目的で本研究を開始した。1)ヒトAK1DNAをさきの報告で人工合成して入手し得たpAKをpMEX8-hAK1へとベクター改築を行い、哺乳動物の間で相同性の高いリジン残基の7個所を対象に、それらに対するXXYコドン(X : A,G,C or T,Y : G or C)で構成されるアンニーリングプライマーを作製してランダムな部位特異的変異導入法の確立を計った。DNAサイクルシークエンスによって変異導入プラスミドのスクリーニングを行って、野生型および短時間に複数の変異型を大腸菌においてタンパク質発現を行い、それぞれの酵素タンパク質を2段階の操作で、精製し、比活性測定、定常状態でのキネティックス解析を行った。2)7つのリジン残基に関して、22種類の変異体が得られ、野生型と比較してタンパク質発現量、比活性値ともに著明に低下していた。K9はATP,AMPの両基質に、K21は両基質ともに相互作用を示し、ATPとの強い相互作用が観察された。K27,K131はATP基質のホールディングに関与するのみならず、そのリン酸転移に寄与していることが示唆された。K63もATPとの強い結合が示唆され、K194はC端に存在していながら、ATP,AMPの両基質とのホールディングにおいて相互作用する証拠が得られた。3)これらの結果を本結晶酵素で得られたX線回折のモデルに挿入してみると、溶液中で行われたNMRモデルを強く支持する酵素一基質相互作用を示す興味ある成果が得られた。

研究成果

• [文献書誌] Ayabe.T.et al.: "Construction of the plasmid pMEX8-hAK1 and random site-directed mutagenesis of human cvtosolic adenylate kinase." Biochem.Mol.Biol. Int.38. 373-381 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ayabe.T.et al.: "Steady-state kinetics of thr35-and Thr39-mutants in human adenylate kinase by site-directed mutagenesis." Enzyme and Protein. (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ayabe.T.et al.: "Catalytic roles of Lysines (K9,K27,K31) in the N-terminal comain in human adenylate kinase by random site-directed mutagenesis." Biochem.Mol.Biol.Int.40. 897-906 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ayabe.T.et al.: "Substrate-binding and catalytic roles of Lys194 in the C-terminus in human adenylate kinase by site-directed random mutagenesis." Biochem.Mol.Biol.Int.41(1). 367-375 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ayabe.T.et al.: "Essential Lysine residues in the N-terminal and the C-terminal domain of humman adenylate kinase interact with adenine nucleotides as found by site-directed random mutagenesis." Biochemistry. (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ayabe, T., Takenaka, H., Takenaka, O., Takenaka, A., Nagahama, H., Maruyama, H., Yamamoto, A., Nagata, M., Koga, Y., Sumida, M., and Hamada, M.: ""Construction of the plasmid pMEX8-hAK1 and random site-directed mutagenesis of human cytosolic adenylate kinase."" Biochem.Mol.Biol.Int.38. 373-381 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ayabe, T., Park, S.K., Takenaka, H., Sumida, H., Uesugi, S., Takenaka, O., and Hamada, M.: ""Catalytic roles of Lysines (K9, K27, K31) in the N-terminal domain in human adenylate kinase by random site-directed mutagenesis."" Biochem.Mol.Biol.Int.40. 897-906 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ayabe, T., Takenaka, H., Onitsuka, T., Shibata, K., Takenaka, O., Uesugi, S., and Hamada, M.: ""Steady-state kinetics of thr35-and Thr39-mutants in human adenylate kinase by site-directed mutagenesis."" Enzyme and Protein. (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ayabe, T., Takenaka, H., Takenaka, O., Sumida, M., Maruyama, H., Onitsuka, T., Shibata, K., Uesugi, S., and Hamada, M.: ""Essential Lysine residues in the N-terminal and the C-terminal domain of human adenylate kinase interact with adenine nucleotides as found by site-directed random mutagenesis."" Biochemistry. (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ayabe, T., Takenaka, H., Takenaka, O., Onitsuka, T., Shibata, K., Uesugi, S., and Hamada, M.: ""Substrate-binding and catalytic roles of Lys194 in the C-terminus in human adenylate kinase by site-directed random mutagenesis."" Biochem.Mol.Biol.Int.41(1). 367-375 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ayabe,T et al.: "Steady-state kinetics of thr35-and Thr39-mutants in human adenylate Kinase by site-directed mutagenesis." Enzyme and Protein. (in press). (1997)
• [文献書誌] Ayabe,T et al.: "Substrate-binding and catalytic roles of Lys194 in the C-terminus in human adenylate kinase by site-directed random mutagenesis." Biochem.Mol.Biol.Int.41(1). 367-375 (1997)
• [文献書誌] Ayabe,T et al.: "Essential Lysine residues in the N-terminal and the C-terminal domain of humman adenylate kinase interact with adenine nucleotide as found by site-directed random mutagenesis." Biochemistry. (in press). (1997)
• [文献書誌] Ayabe,T.,Takenaka,H.et al.: "Structure and function of an engineersd K21,K27 and T39 in human adenylate kinase" Abstract of 8th International Congress on Isozymes. 42 (1995)
• [文献書誌] Ayabe,T.,Takenaka,H.et al.: "Site-directed random replacements in both N-terminal region and C-terminus of human adenylate kinase." ibid. 52 (1995)
• [文献書誌] Hamada,M.,Ayabe,T.,Takenaka,H.et al.: "Essential KeyLysine Residues(K9,K21,K27,K31andK194)at MgATP Binding Site in N-and C-Terminus Domain of Human Adenylate Kinase(AKl)" Premier Colloque INternational sur L′Etude de nm23/NDP Kinase. 8 (1995)
• [文献書誌] Ayabe,T.,Hamada,M.,Takenaka,H.et al.: "Structural and Functional Role of Threomine Residues(T35,T39)in N-Terminal Domain of Human Cytosolic Adenylate Kinase." ibid. 2 (1995)
• [文献書誌] Ayabe,T.,Takenaka,H.et al.: "Construction of the Plasmid pMEX8-HAKl and Random Site-Directed Mutagenesis of Human Cytosolic Adenylate Kinase." Biochemistry and Molecular Biology International. 38. 373-381 (1996)
• [文献書誌] Ayabe,T.,Takenaka,H.,Hamada,M,et al.: "Site-directed random mutagenesis of the C-terminal residus(K194)of Human Adenylate Kinase." American Society for Biochemistry and Molecular Biology Meeting New Orleans. (1996)