| 研究課題/領域番号 |
07457412
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
眼科学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
下村 嘉一 大阪大学, 医学部, 助教授 (20162737)
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| 研究分担者 |
林 皓三郎 神戸市環境保健研究所, 所長
渡辺 仁 大阪大学, 医学部, 助手 (60252673)
切通 彰 大阪大学, 医学部, 講師 (10225104)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
4,900千円 (直接経費: 4,900千円)
1996年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1995年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
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| キーワード | 単純ヘルペスウイルス1型 / PCR / 定量化 / 角膜炎 / マウス / 単純ヘルペスウイルス / 培養法 / 眼局所 / 三叉神経節 |
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| 研究概要 |
I.single PCR法で検出可能なDNA量の特定とマウスを用いたPCR法の定量化
通常のsingle PCR法では、0.2ngのDNAが検出可能であり、これは400PFUに相当したことが判明した。さらに、マウスの実験系を用いて、titlationとDNA量の推移を検討した結果、titlationでは涙腺で10^2のorderで検出できたが、眼球、三叉神経節に比べると低値であった。DNAの定量に関しては、感染2日目から眼球にDNAが出現し、徐々に低下したが、三叉神経節と涙腺においては、2日目にはDNAは検出不能であったが、4日目から出現し、6日目には減少し、8日目には検出限界以下であった。
上記結果から、より精密なPCR法の定量にはsingle PCR法ではなく、以下に示すCompetitive PCR法を用いる事になった。
II.Competitive PCR法におけるHSV-1 DNA量の定量
糖蛋白質Dを標的にしたプライマーを選択した。40bp deletion したCompetitor(p/△HSV-1)の希釈列を作成し、各p/△HSV-1希釈液とHSV-1 genomeをtemplateとして同一反応液に入れ、PCRを施行した。PCR産物をSYBR Green I染色後、Fluor Imager 595にてスキャンし蛍光強度を測定することで、HSV-1 genomeのcopy数を予測した。
Competitor単独でのPCRの蛍光強度測定では、21〜25サイクルまでは比較的増幅していた。一方、HSV-1 genome単独の場合は、21〜27サイクルまで比例的に増幅しており、両者の結果から21〜25サイクルの間であれば、doseが変化しても定量が可能であった。従って、HSV-1 genomeとCompetitorの希釈液をtemplateとしてCompetitive PCRを25サイクルで施行した場合、HSV-1 genomeのdose 780pgはバンドの蛍光強度が同じであるCompetitorのcopy数、10^7 copyに相当すると考えられた。
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