| 研究課題/領域番号 |
07457420
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
小児外科
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上井 義之 (1996) 東京大学, 医学部・附属病院, 助手 (70177567)
土田 嘉昭 (1995) 東京大学, 医学部(病), 教授 (80010164)
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| 研究分担者 |
尾花 和子 東京大学, 医学部・附属病院, 助手 (60272580)
土田 嘉昭 群馬県立小児医療センター, 院長 (80010164)
逸見 仁道 東邦大学, 医学部, 助教授 (90165514)
上井 義之 東京大学, 医学部(病), 助手 (70177567)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | 神経芽細胞腫 / N-Myc蛋白 / ELISA / MAP法 / recombinant N-Myc / ペプチド抗体法 / N-myc / c-myc / ペプチド抗体 |
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| 研究概要 |
神経芽細胞腫のがん遺伝子であるN-mycの異常発現を、その産物であるN-Myc蛋白の定量により知ることは極めて重要である。平成7年度、並びに、平成8年度の2年間、サンドウィッチ型ELISA法の確立を目標として、以下の研究を行った。
(1)MYC系遺伝子間で相同性の高い領域(pan-myc領域)を含むDNA断片よりpan-Myc蛋白を精製して、家兎に免疫し、ポリクローナル抗体が既に得られている。これをELISA法における第一抗体として用いることとした。
(2)N-Myc蛋白全体の中から本蛋白に特異的し考えられる2種のペプチドを選び、これらを合成し、MAP法にて家兎を免疫、ポリクローナル抗体を得た。上記の2種のペプチドのうち、17個のアミノ酸(codon223-239)からなるペプチドより、特異性が高く、抗体価のいちじるしく高い抗体が得られ、アフィニティカラムにより抗N-Myc蛋白特異IgGにまで精製することができた。
(3)ELISA法のための標準蛋白として、N-mycDNAのうちexon2とexon3から一定の長さのDNAをクローンし、発現ベクターpET16bに挿入、大腸菌によりN-Myc蛋白を得た。本蛋白は、大きさが38kDaと本来のN-Myc蛋白よりもやや小さいが水溶性(本来のN-Myc蛋白は水に難溶性)であることが確認された
(4)続いて、ELISAによる定量法の樹立の実験に移ったが、このとき、今までに度々行ってきた予備実験により、確保されている筈の抗pan-Myc蛋白抗体の量が予想外に少なくなっていることが明らかとなり、これだけの第一抗体の量ではサンドウイッチ型ELISA法は組めないものと結論した。現在、標準蛋白をI^<131>で標識して競合反応を行わせるRIA法の実験に移行している。
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