| 研究課題/領域番号 |
07458176
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物物理学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
神山 勉 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (30170210)
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| 研究分担者 |
岡田 哲二 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 助手 (10271545)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
7,100千円 (直接経費: 7,100千円)
1996年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
1995年度: 4,800千円 (直接経費: 4,800千円)
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| キーワード | 生体膜 / 膜蛋白質 / バクテリオロドプシン / ロドプシン / 結晶化 / X線結晶構造解析 / 蛋白質精製法 / 光捕集クロロフィル蛋白質複合体 / 精製 / 界面活性剤 / 小胞 / 脂質 |
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| 研究概要 |
膜蛋白質の結晶構造解析の成功例がいくつか報告されているものの、膜蛋白質の結晶化には多大な労力が伴われる。安定で高純度・高濃度の標品を得るのが難しいからでである。我々は膜蛋白質の精製の簡略化を目指して、膜蛋白質の凝集を促すことにより特定の膜蛋白質だけからなる球殻状集合体を形成させる方法の開発を行った。
高度好塩菌に見いだされたバクテリオロドプシンは生理的条件で紫膜と呼ばれる二次元結晶を作る。紫膜に少量の界面活性剤(オクチルグルコシド)と結晶析出剤を加えると、不定形のチューブ状構造体とともに50nm径の球殻構造体ができるが、球殻構造体への変換効率が最適条件(高温域)で100%近くなること、逆に低温域では球殻状集合体が不安定になることを明らかにした。また、球殻構造体を互いに融合させてできる平面膜を累積するという方法を開発することにより良質の三次元結晶を得、3A分解能のX線回析データを収集するのに成功した。結晶の空間群(P622)及び格子定数(a=b=104.7Å、c=114.1Å)を求め、バクテリオロドジプシン三量体が蜂の巣格子上に並んだパッキング構造を明らかにした。三量体中に脂質分子が強く結合しており、蛋白質間の接着材の様な働きをしていることを明らかにした。
エンドウの光捕集クロロフィル蛋白質複合体も結晶化条件で27nm径の球殻構造体を形成すること、また、この球殻構造体は三次元的に集積して正八面体の結晶(空間群P2_13、格子定数a=b=c=390Å)を作ることを示した。
7回膜貫通型膜蛋白質であるウシ・ロドプシンの精製も試み、新しい方法を開発した。視覚細胞の円盤膜を密度勾配遠心法により精製し、これを界面活性剤(アルキルグルコシド)と高濃度の亜鉛イオンで処理して遠心分離を行うという操作だけで、高純度のロドプシン試料を得ることができた。得られた濃厚試料に結晶析出剤を加え、蒸気拡散法により蛋白質を塩斥することにより三次元結晶を得ることができた。
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