| 研究課題/領域番号 |
07556073
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
応用分子細胞生物学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小林 達彦 京都大学, 農学部, 講師 (70221976)
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| 研究分担者 |
片岡 道彦 京都大学, 農学部, 助手 (90252494)
清水 昌 京都大学, 農学部, 教授 (70093250)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
6,400千円 (直接経費: 6,400千円)
1996年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1995年度: 4,300千円 (直接経費: 4,300千円)
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| キーワード | ニトリル / プロモーター / 遺伝子 / 誘導 / 発現 / アミド / イソバレロニトリル / ニトリルヒドラターゼ / Rhodococcus / 塩基配列 |
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| 研究概要 |
Rhodococcus rhodochrous J1が生成する高分子量型ニトリルヒドラターゼ(H-NHase)および低分子量型ニトリルヒドラターゼ(L-NHase)について、各々対応する遺伝子(nhhBAおよびnhlBA)の発現に関わる調節領域の特定を行うとともに、遺伝子プロモーターの同定を行った。さらに、培養条件を選択することにより本菌が生成するニトリラーゼの発現調節機構の解析を行うとともに、本遺伝子プロモーターの同定を行った。
(1) H-NHase遺伝子(nhhBA)について、nhhBAの発現に必須の4.6kbの領域の塩基配列を決定した結果、本領域には、大腸菌由来の調節遺伝子marRやhpcRと相同性を示す遺伝子nhhDとPseudomonas aeruginosaのアミダーゼの負の調節遺伝子であるamiCと相同性を示す遺伝子nhhCが存在した。また、これらの調節遺伝子はnhhBAの(尿素などの)アミド化合物による誘導発現において転写レベルの制御に関わっていた。さらに、nhhBAのmRNAへの転写は開始コドンより上流71ベース及び48ベースの2点から始まっていることを明らかにしプロモーター領域の特定に成功した。さらに、本4.6kbの領域とともにnhhBAをR. rhodochrous ATCC12674で発現させた結果、その無細胞抽出液の50%以上をH-NHaseが占めていた。
(2) L-NHase遺伝子(nhlBA)について誘導発現調節機構の解析を行った結果、nhlBAより上流部分を少なくとも約3.5kb含むクローンは全て(誘導物質である)アミドによりL-NHaseを誘導生成するのに対し、上流領域をさらに切り縮めたクローンはアミドの有無に関わらずL-NHaseが構成的に発現した。アミドによる誘導発現に関わる上流域には、二つのORF(nhlDとnhlC)が存在し、nhlCは正の、nhlDは負の調節遺伝子であった。また、nhlDが水銀、カドミウム、ひ素などの重金属を解毒あるいは細胞外へ排出する機能を持つタンパク質をコードする遺伝子の発現調節に関わるタンパク質と相同性を示したのに対し、nhlCはnhhCやamiCと相同性を示した。
(3) R. rhodochrous J1菌のニトリラーゼのイソバレロニトリルによる誘導発現調節機構の解析を行った結果、ニトリラーゼ遺伝子(nitA)より1.4kb下流に存在する領域が、ニトリラーゼのイソバレロニトリルによる誘導発現に関わることが判明した。本領域には、一つのORF (nitR)が存在し、nitRから予想されるアミノ酸配列は、Pseudomonas putidaのキシレン代謝系遺伝子の誘導発現を正に調節するXylSおよび大腸菌のアラビノース代謝系遺伝子の誘導発現を調節するAraCと相同性を示した。また、nitAの転写開始点は開始コドンより26bp上流のCであった。さらに、nitA上流域の種々のデリーションクローンを作製し、nitAのプロモーターとして機能する領域を特定した。
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