| 研究課題/領域番号 |
07556115
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
応用動物科学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
酒井 仙吉 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (80114487)
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| 研究分担者 |
河本 馨 日本獣医畜産大学, 獣医学部, 客員教授 (30011894)
青木 不学 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (20175160)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1996年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | コンペティティブRT-PCR / 蛍光標識プローブ / キャピラリー電気泳動 / カゼイン / カゼインmRNA / フローレスチン / 乳腺 / コンペティタ-DNA / ノーザンブロット / RNA分析法 / FITCラベル / ラベルプローブ / レーザー分析法 |
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| 研究概要 |
カゼインcDNAのクローン化とコンペティティブRT-PCRの確立:分子量2.2万のカゼインmRNAから相補DNAをクローン化し、その塩基配列を決定した。乳腺組織に存在するカゼインmRNAを定量するため、コンペティティブRT-PCRを確立した。用いたコンペティタ-DNAは、相補DNAに外来遺伝子を導入して作成した。
動物実験条件の確立:泌乳中の乳腺においてカゼインmRNAは分娩後から増加し、泌乳最盛期で最大となった。その後徐々に減少した。泌乳を強制的に停止させるとカゼインmRNAは9時間後から急速に減少し、哺乳を再開させると増加した。カゼインmRNAが大きく変化する動物実験条件を明らかにした。
蛍光標識プローブの作成:フローレスチン標識ヌクレオチドを用いPCRにより、センスプライマーとアンチセンス-プライマーの作成を行った。しかし、標識度が低く実験用の標識プローブとして用いることが出来なかった。約400塩基のPCR断片をプラスミドに導入し、制限酵素(Spel 1)により切断後、標識ヌクレオチドの存在下でT7及びSP6ポリメラーゼを用いて標識したRANプローブを作成した。
電気泳動によるRNAの分離:キャピラリー電気泳動装置を使用して泳動条件を検討した。標準物質としてフローレスチン標識ヌクレオチド及び合成した標識RNAプローブを用いた。フローレスチン標識ヌクレオチド10^<-15>モルの検出感度が得られた。また、合成した標識RNAプローブにおいては泳動パターンが鋭敏でなく目下検討中である。
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