| 研究課題/領域番号 |
07556124
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
応用獣医学
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
森 純一 北里大学, 獣医畜産学部, 教授 (90167685)
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| 研究分担者 |
伊原 武志 財団法人, 日本生物科学研究所, 研究員 (70150109)
稲葉 俊夫 大阪府立大学, 農学部, 助教授 (00137241)
加藤 幸雄 群馬大学, 生体調節研究所, 助教授 (30114177)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1996年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | 性腺刺激ホルモン / 組換えDNA / ブタ / バキュロウィルスベクター / 胚移植 / 卵胞刺激ホルモン / 黄体形成ホルモン / バキュロウイルスベクター |
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| 研究概要 |
純粋な卵胞刺激ホルモン(FSH)の産生を企図して、遺伝子工学技術の応用による組換えFSHの産生を試み、その生物活性を天然のFSH標準品と比較検討した。本実験に先立ち、従来のラジオイムノアッセイ法に劣らない、時間分解蛍光測定法(TR-FIA)によるFSHの微量測定法を確立した。次に、ブタFSHα鎖、β鎖のcDNAを組込んだカイコウィルス発現ベクターを構築し、α鎖およびβ鎖を単独に発現させた結果、それぞれ15kdおよび18kdの分子量のタンパクが産生された。これらのタンパクはそれぞれFSHに特異的な抗血清と反応し、また糖鎖の付加が確認できた。活性型(2量体)のFSHを得るためには変性と巻き戻しを試みたが、その効果は非常に低いものであった。そこで、α鎖とFSHβ鎖ベクターの重感染の系および1つのベクター内に2つのプロモーターを持つものを選び、それぞれのプロモーターの後ろにα鎖とFSHβ鎖のcDNAを別々に連結した系について検討した。いずれの系でもほぼ同等の2量体の発現が確認された。この時点での発現量は、0.1〜0.5μg/ml程度であった。発現量を上げるために、細胞をSf21から分泌型の発現に適したTn5に変えた結果、発現量は1〜4μg/mlとなった。同時にその後の精製に便利なように無血清培地に変えた。このシステムを用いて組換えバキュロウィルスの大量培養を行った。この時の発現量は、約2μg/mlであり、11培養上清より750μgの精製FSHを得ることができた。なお、FSHの精製は、イオン交換樹脂および糖鎖と結合する特性をもつコンカナバリンA樹脂を用いて、比較的簡単に高純度のFSHを得ることができた。精製したFSHについて、ブタ体外受精系における卵子の第一次減数分裂開始の活性をもつこと、ラットの卵巣重量、子宮重量、成熟卵胞数を下垂体由来のFSHと同じレベルで増加させること、さらに、マウス間質細胞を用いてLH混入が全くないことを明らかにした。さらに、このFSHは妊馬血清性性腺刺激ホルモン(PMSG)前処理・下垂体摘出ラットにおいて排卵誘起作用を有し、排卵に関与する組織型プラスミノーゲンアクチベータ-のmRNAの発現も有意に増加することを明らかにした。また、LHについての発現は、バキュロウィルスとSf21による発現の検討を行ったが、イムノブロッティングによってLHβ鎖に特異的なバンドを検出するに至らなかった。
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