| 研究課題/領域番号 |
07557003
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
解剖学一般(含組織学・発生学)
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
山科 正平 北里大学, 医学部, 教授 (90013987)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
15,900千円 (直接経費: 15,900千円)
1997年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1995年度: 13,800千円 (直接経費: 13,800千円)
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| キーワード | SPM / 細胞の超微細構造 / 生体膜 / 分子解剖 / 凍結割断 / 免疫組織化学 / 酵素組織化学 / コロイド金粒子 / 走査型プローブ顕微鏡 / 細胞構造 / 組織化学 / AFM / DFM / 凍結技法 |
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| 研究概要 |
現行のSPM装置によって、1)細胞の微細構造がどこまで詳細に解像できるか、2)微細構造上における機能物質の同定が可能か、という問題の解決に向けて研究を進め、以下の成果を得た。
(1)細胞超構造の観察
色々な方法で作成した標本の切片について比較検討した結果、80nm厚の凍結超薄切片を風乾あるいは臨界点乾燥したものを、先端曲率半径が10nm以下の探針を用いてサイクリックコンタクトモードで観察するのが現状では最善であることが判明した。これにより約30nmの解像力が確保されている。しかし、この解像力では生体膜の断面は一条の隆起として認められるのみで、脂質2重層に対応する像は解像されていない。更に解像力を向上させるためには探針の更なる鋭利化が求められている。
(2)凍結割断-SDS処理標本
凍結割断試料のSDS処理により親水面を露出させた材料で調査を進め、膜の真表面に約30nmの隆起物が認められるようになってきたが、それがいかなる分子あるいは分子集合体に由来するかを解像をするまでには至っていない。
(3)細胞に標識した物質の同定技術の開発
i)AFMによるコロイド金の同定
免疫組織化学あるいはレクチン組織化学法によりコロイド金を標識した材料で、金粒子の同定を試みた。その結果、直径15nmまでのコロイド金粒子はAFMにより容易に同定されるが、それより小型のもになると細胞構造の凹凸に埋没して判別が困難になることが明らかになった。また金粒子の直径は期待値よりかなり大きく、探針による側方効果が効いてくるためである。コンピュータの演算処理により側方効果を補正する案をAFMメーカーに提案中である。
ii)組織化学反応産物のKFMによる同定
コロイド金、および鉛法の酵素組織化学法の最終産物であるリン酸鉛を局所の表面電位差を測定するKFMモードにより検出を試みた。それにより直径20nmのコロイド金粒子ならば約120mVの表面電位差として、アルカリフォースファターゼや酸性フォースファターゼの酵素組織化学反応による最終産物のリン酸鉛約400mVの電位差として透過電顕的に観察されると同じ領域に検出された。しかし、現状のKFMモードのトポ像の解像力がAFMに比して劣ることと、検出感度が低いことにより高倍率でのみ検出され、低倍像では検出されないなどの問題があった。
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