| 研究分担者 |
河野 雅弘 日本電子(株), 分析機器技術本部・応用研, 研究室長
季 昌一 (李 昌一) 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (60220795)
高橋 俊介 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (60206810)
塗々木 和男 神奈川歯科大学, 歯学部, 講師 (90139577)
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| 研究概要 |
病態と関連した活性酸素ラジカル種の計測法を確立し,in vivoでの検出に応用できる技術の開発を試みた。
1.活性酸素ラジカル種の計測法
(1)過酸化水素とペルオキシダーゼ酵素:鉄キレーターであるデスフェリオキサミン(DFX)がペルオキシダーゼ(PR)存在下で過酸化水素(H_2O_2)によって一電子酸化を受けてDFXラジカル分子となることを利用し,ESR法で定量できることを確認した。測定感度はH_2O_2およびPRとしてμMオーダーであった。
(2)NOラジカルの定量:ジチオカルバメート鉄錯体(DTCS-Fe)をNOトラッパーとして用い,NOドナーであるNOC-7から放出されるNOラジカルの定量をESR法で試みた。検出感度は1μM以下であった。
(3)一重項酸素の検出:2,2,6,6-terameethylpiperidine-N-oxide(TEMP)を用い、TEMP→TEMPO反応をESRで計測することにより,一重項酸素検出を可能にした。
(4)オプティカルバイオセンサー:バッチ四機チャンバーに酵素を固定することにより,基質を定量するシステムを開発した。酵素の種類を自由に選択することが可能なので,生体内で活性酸素フリーラジカル生成に関与する酵素反応系の変動を検出することができる。
2.酸素由来ラジカル種の生体内挙動
(1)口腔付近の酸化還元状態:L-バンド帯域でin vivo ESR計測を行い,安定ニトロキシドラジカルをプローブとしてマウス腹部および口腔付近の酸化還元状態を評価した。その結果、口腔付近では酸化還元状態が低いことが示唆された。
(2)歯髄循環とNOラジカル:ヒドロキシラジカルがイヌ歯髄血管内皮細胞を傷害する結果,内皮由来NOラジカル合成段階を抑制することを確認した。このことは,歯髄血流量が少なくともNOラジカルによって調節されていることを示唆する。
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