| 研究課題/領域番号 |
07557179
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
病態検査学
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
猪子 英俊 東海大学, 医学部, 教授 (10101932)
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| 研究分担者 |
瓜生 登 ニチレイ研究所, 遺伝子ラボ, 研究員
安藤 麻子 東海大学, 医学部, 講師 (40101935)
辻 公美 東海大学, 医学部, 教授 (30055834)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
7,800千円 (直接経費: 7,800千円)
1996年度: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
1995年度: 4,100千円 (直接経費: 4,100千円)
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| キーワード | HLA / DNAタイピング / PCR-RFLP法 / 蛍光標識 / 蛍光アミダイド / 自動シーケンサー / 多型性 / DQA1遺伝子 / PCR-RFLP / 自動化 / 蛍光標識プライマー / 制限酵素 / GENESCAN / ジェノタイパ- |
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| 研究概要 |
簡便かつ精度の高いHLA-DNAタイピング法であるPCR-RFLP法の全自動化機械の開発を目的として、電気泳動のバンドパターンのスキャンニングによる検出とHLAタイプの判定の行程を中心に自動化の問題点となる過程(プライマーの蛍光標識やPCR産物の濃度、バンドパターンの解析によるタイピングなど)について解析、検討した。プライマーの蛍光標識は、アミノリンク2と蛍光アミダイドを用いて検討を行ったところ、アミノリンク2と比較してプライマーの標識試薬として安定性の高い蛍光アミダイドによる蛍光標識は、強度が一定で良好な結果が得られることが明らかになった。この蛍光アミダイドによるDQA1遺伝子の5′側を標識したプライマーを用いたPCRと自動シーケンサーによるバンドパターンの解析の組み合わせによって、HLAホモ接合体細胞DNA4例及び、一般健常人DNA14例すべてのDQA1遺伝子のタイピングが可能であり、これらの結果は、従来のPCR-RFLP法によるタイピング結果と一致した。今回の方法は、1ng前後の微量な増幅DNAでタイピングが可能な感度の高い方法であり、従来の方法では、検出不能な微量DNAサンプルや、不純物の混入などによる増幅効率の不良なDNAサンプルなどにも有効な方法であると考えられる。さらに特異的なバンドと非特異的なバンドとの区別は、バンドパターンのフラグメントサイズや、バンド面積の表示によって容易であった。また、多種類の蛍光アミダイドによる標識プライマーは、多数検体のタイピングに有効であると考えられる。今後は、さらに泳動時間や解析ソフトウェアの作成による解析時間の短縮と操作性の向上によって多検体処理可能で、迅速かつ信頼度の高いHLA-DNAタイピングの自動化機械の実現性を追求していく予定である。
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