| 研究課題/領域番号 |
07557298
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
物理系薬学
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
中村 洋 東京理科大学, 薬学部, 教授 (60092285)
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| 研究分担者 |
吉田 彰 三菱化学(株), 四日市総合研究所, 企画管理室長
加藤 芳男 東リー(株), 科学計測事業部, 部長
鈴木 政雄 東京理科大学, 薬学部, 講師 (50089330)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
5,100千円 (直接経費: 5,100千円)
1996年度: 5,100千円 (直接経費: 5,100千円)
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| キーワード | チタニア / リン酸化合物 / リン酸化タンパク質 / 高速液体クロマトグラフィー / カラムスイッチング / ケモアフィニティー / 陰イオン交換分離 / プレコンセントレーション / 陰イオン交換カラム / リン酸化ペプチド / 生体試料 / イオン交換分離 |
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| 研究概要 |
1.材料の調製(1)高性能チタニア粒子の製造と物性測定:ゾル-ゲル法によりチタニア並びにハイブリッド型チタニア(チタニアーシリカ等)を合成した。後者はリン酸化合物に対し、構成する金属酸化物単独にはない新しい保持特性を示した。(2)リン酸化ペプチド、タンパク質のin vitro合成と精製:KemptideやMalantideを酵素的にリン酸化し、標品を得た。2.リン酸関連化合物の吸着・脱着・分離・検出条件の検討(1)リン酸化合物のチタニアカラムへの吸着・溶離条件:リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、ヌクレオチドでは、0.015%トリフルオロ酢酸(TFA)で吸着させ、LiC1を含む50mMホウ酸塩緩衝液(pH8.0)(溶離液A)で溶離する条件が、リン脂質ではクロロホルムで吸着し、クロロホルム-イソプロパノールーリン酸(7:14:5)で回収する条件が最適であった。(2)陰イオン交換HPLCによるリン酸関連化合物の分離条件の検討:有機リン酸化合物をAsahipak NH2P-50カラムを用いてグラジエント溶離後、リンモリブデン酸反応で検出する系を確立し、ラット心筋中リン酸化合物の分析に応用した。3.リン酸化タンパク質解析ソフトの開発(1)リン酸化タンパク質の酵素加水分解による断片化:ウサギホスホリラーゼaのトリプシン消化により、リン酸化ペプチドの生成が確認できた。(2)チタニアカラムにるリン酸化ペプチドの選択的捕集:0.015%TFAで吸着させ、溶離液Aで溶出する条件下、リン酸化Kemptideの回収率は80%以上であった。(3)陰イオン交換HPLCによるリン酸化ペプチドの単離:Asahipak NH2P-50カラムと移動相Aの組合せが適当であった。4.リン酸化タンパク質解析システムの構築 UV検出またはUV検出とポストカラム蛍光検出(OPA)の二重検出装置を組込んだ、チタニアカラムと陰イオン交換カラムからなるカラムスイッチングHPLCシステムを構築し、微量リン酸化ペプチドの選択的検出または単離を可能とした。
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