無毒性ジフテリア毒素の改変による腫瘍増殖因子抑制物質の作製

• 研究課題/領域番号: 07557335
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 試験
• 研究分野: 細菌学(含真菌学)
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 目加田 英輔 久留米大学, 分子生命科学研究所, 教授 (20135742)
• 研究分担者: 三田村 俊秀 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (80268846) ; 馬田 敏幸 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (30213482) ; 岩本 亮 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (10213323)
• 研究期間 (年度): 1995 – 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円); 1996年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
• キーワード: ジフテリア毒素リセプター / ジフテリア毒素 / CRM197 / HB-EGF / EGFリセプター / 腫瘍増殖因子抑制物質

研究概要

本研究は、ジフテリア毒素リセプターがHB-EGFと云うEGFリセプターに結合する増殖因子であること、ジフテリア毒素、あるいはその無毒性変異蛋白CRM197は、HB-EGFに結合することでそのEGFリセプターへの結合を阻害する事実に基づき、CRM197を改変することで、HB-EGF以外のEGFファミリーの増殖因子の特異的阻害剤の作成を目的としている。この目的に沿って以下の実験を行い次のような成果を得た。
(A)ジフテリア毒素結合部位の詳細な解析
EGFドメインに結合する分子を作成するためには、ジフテリア毒素のHB-EGF結合部位について分子レベルでの理解が必須である。そこで、HB-EGFのEGFドメインを改変した数多くのミュータントを作製し、これを細胞に発現させ、そのプロダクトのジフテリア毒素結合活性を測定した。また、すでに報告されているEGFやTGF-αの立体構造を元にHB-EGFの立体構造を推定し、ジフテリアの毒素の立体構造のデーターやミュータントの結果と重ね合わせて考察を行った。その結果、HB-EGFのジフテリア毒素結合部位、ECFリセプター結合部位について立体構造にかなり具体的なイメージを得ることが出来た。
(B)GST融合蛋白の作成
ジフテリア毒素のRドメインとGSTの融合蛋白を各種作成し、結合活性を示すかどうかを調べた。その結果、作成したあるGST-Rドメイン蛋白は十分なジフテリア毒素リセプター結合活性を保持していた。このことから、この融合蛋白をベースに、この一部を改変することで他のEGFファミリー増殖因子結合能を持った分子スクリーニングできることが判った。これらの成果から、本研究はCRM197の改変に向けて大きく前進することが出来た。現在最終目的に向けて実験を開始している。

研究成果

• [文献書誌] Tsuneoka,M.: "c-myc activates RCC1 gene expression through E-box elements." Oncogene. (in perss).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nakagawa,T.: "Amino-terminal Processing of cell surface heparin-binding EGF-like growth factor upregulates its juxtacrine but not its pafacrine growth factor activity." J.Biol.Chem.271. 30858-30863 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nakamura,Y.: "Expression and distribution of CD9 in myelin of the central and peripheral nervous systems." Am.J.Pathol.149. 575-583 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Tsuneoka,M.: "c-myc activates RCC1 gene expression through E-box elements." Oncogene. (in press).
• [文献書誌] Nakagawa,T.: "Amino-terminal processing of cell surface heparin-binding EGF-like growth factor upregulates its juxtacrine but not its paracrine growth factor activity." J.Biol.Chem.271. 30858-30863 (1996)
• [文献書誌] Nakamura,Y.: "Expression and distribution of CD9 in myelin of the central and perpheral nervous systems." Am.J.Pathol.149. 575-583 (1996)
• [文献書誌] Mitamura,T.: "Diphtheria toxin binds to the EGF-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor, and inhibits specifically its mitogenic activity." J.Biol.Chem.270. 1015-1019 (1995)
• [文献書誌] Higashiyama,S.: "The membrane protein CD9/DRAP27 potentiates the growth factor activity of the membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth facor (HB-EGF)." J.Cell Biol.128. 929-938 (1995)
• [文献書誌] Nakamura,K.: "Membrane anchored heparin-binding EGF-like growth factor and DRAP27/CD9 form a complex with integrin 3 l at cell-cell contact sites." J.Cell Biol.129. 1691-1705 (1995)
• [文献書誌] Goishi,K.: "Phorbol ester induces the rapid processing of cell surface heparin-binding EGF-like growth factor; Conversion from juxtacrine to paracrine growth factor activity." Mol.Biol.Cell. 6. 967-980 (1995)
• [文献書誌] Shishido,Y.: "Heparin-like molecules on the cell surface potentiate binding of diphtheria toxin to the diphtheria toxin receptor/membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor." J.Biol.Chem.270. 29578-29585 (1995)
• [文献書誌] Mekada,E.: "Handbook of natural toxins: Volume 8, Bacterial toxins and virulence factors in disease" Moss,J.,Iglewski,B.,Vaughan,M.& Tu,A.T.(Marcel Dekker Inc.,New York), 15 (1995)