| 研究課題/領域番号 |
07558092
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
山形 達也 東京工業大学, 生命理工学部生体分子工学科, 客員教授 (10251654)
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| 研究分担者 |
日向 昌司 東京工業大学, 生命理工学部・生体分子工学科, 教員 (50251658)
山本 久夫 生化学工業(株), 東京研究所探索1研究室, 室長
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
1996年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
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| キーワード | グリコシダーゼ / ザイモグラフィー / p-ニトロフェニルグリコシド / β-ガラクトシダーゼ / ヒアルロニダーゼ / エンドグリコセラミダーゼ / 酵素の人工基質 / コンドロイチナーゼ |
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| 研究概要 |
(1)ゲル中で安定に保持されるグリコシダーゼの基質の開発
市販されているp-ニトロフェニルグリコシドはグリコシダーゼのよい基質となることが知られているが、反応生成物であるp-ニトロフェノールはゲルに留まらないためにザイモグラフィーに用いることが出来ない。それで、4-ニトロー2-アルキルアミノフェニルβ-D-ガラクトシドを合成した。アルキル基がC6以上になると反応生成物がゲルに沈着するので、ザイモグラフィーにおける良い基質となることを明らかにした。
(2)血清中のグリコシダーゼ
p-ニトロフェニルグリコシドを基質にして各種疾患患者の血清中のグリコシダーゼ活性を測ったところ、乾せん症患者でβ-ガラクトサミニダーゼ、関節水腫患者でβ-グルコシダーゼ、アトピー性皮膚炎患者でヒアルロニダーゼが亢進していることを見出した。正常血清に存在するグリコシダーゼと同一の分子種か、別種のものか、或いは細菌感染によるものかを明らかにするためには本法によるザイモグラフィーが強力な武器になる。
(3)エンドグリコシルセラミダーゼ(EGCase)の人工基質の開発
EGCaseは糖脂質をオリゴ糖とセラミドに加水分解する酵素で、基質として一番小さい糖脂質はラクトシルセラミドであるが、p-ニトロフェニルラクトシドは基質とはならない。2-N-アルキルアミノ-4-β-ニトロフェニルβ-ラクトシドを合成してKmを調べたところ、Corynebacterium、Rhodococcus、ヒル由来のそれぞれのEGCaseで、1.4mM、2.9mM、28μMであり、酵素の優れた人工基質となることを明らかにした。エキソ型の分解酵素による攻撃から基質を守るために、上記の化合物の末端に硫酸エステルをつけ、3′OSO_3H-、6′OSO_3H-ラクトシドを合成したところ、後者がEGCaseで更に良く切れるので、良い基質となることを見出した。
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