真核生物染色体DNA複製蛋白複合体の多量発現ベクター開発と簡易精製法の開発

• 研究課題/領域番号: 07558101
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 試験
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 杉野 明雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90231737)
• 研究分担者: 正井 久雄 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (40229349) ; 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス科, 助教授 (30163885) ; 伊藤 建夫 信州大学, 理学部, 教授 (40051817) ; 真木 寿治 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス科, 教授 (20199649) ; 真木 智子 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (60212205)
• 研究期間 (年度): 1995 – 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 21,300千円 (直接経費: 21,300千円); 1996年度: 7,000千円 (直接経費: 7,000千円); 1995年度: 14,300千円 (直接経費: 14,300千円)
• キーワード: DNA複製複合体 / 多量発現ベクター / バキューロウイルスベクター / 昆虫細胞 / 出芽酵母 / Cdc7-Dbf4 protein kinase複合体 / RF-C複合体 / DNAポリメラーゼ複合体 / バキュロウイルスベクター / YACベクター / Cdc7-Dbf4複合体 / RFC複合体

研究概要

去年は出芽酵母染色体DNA複製開始に必要なCdc7-Dbf4 protein kinase複合体をバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞Ff9で多量発現に成功したので本年度はこの複合体の簡易精製法の開発に努力した。その結果、世界で初めてProtein kinase活性をもつCdc7-Dbf4複合体を多量に得ることができた。これを利用し、Cdc7-Dbf4複合体は特異的に染色体DNA複製ライセンス因子と考えられているMcm2, 3, 4及び6をリン酸化することを明らかにした。一方、五つのサブユニットからなる出芽酵母RF-C複合体を出芽酵母発現ベクターを用いて出芽酵母細胞内で多量発現させることが出来た。そこで、PCNAを共有結合させたSepharoseを用いたaffinity精製法を確立し、簡易でかつ迅速なRF-C複合体の精製方法を確立した。
出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼδ及びε複合体の構造を明らかにし、それらの多量発現を出芽酵母及び昆虫細胞を用いて試みた。現在まで、特にDNAポリメラーゼ触媒サブユニットをコードする遺伝子が大腸菌内で非常に不安定で(ある時は、遺伝子内の欠失や遺伝子そのもののcloningがうまく行かないなど)、多量発現は成功していない。

研究成果

• [文献書誌] Sugimoto, K.: "Rfc5, a small subunit of replicaton factor C complex, couples DNA replication and mitosis in budding yeast." Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 93. 7048-7052 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Noskov, V.: "The RFC2 gene encoding the third largest subunit of the RF-C complex is required for chromosomal DNA replication and cell cycle checkpoint in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Mol. Cell Biol.17 (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sugino, A.: "Overproduction and affinity purification of Saccharomyces cerevisiae replication factor C." J. Biol. Chem.272 (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hashimoto, K.: "The second subunit of DNA polymerse III (δ)is encoded by the HYS2 gene in Saccharomyces cerevisiae." J. Biol. Chem.272 (in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sugimoto, K,Shimomura, T., Hashimoto, K., Araki, H., Sugino, A., and Matsumoto, K.: "Rfc5, a smalll subunit of replication factor C complex, couples DNA replication and mitosis in budding yeast" Proc.Natl.Acad.Sci., USA,93. 7048-7052 (1996)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Noskov, V., Araki, H., and Sugino, A.: "The RFC2 gene encoding the third subunit of the RF-C complex is required for chromosomal DNA replication and cell cycle checkpoint in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Mol.Cell.Biol.(in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sugino, A., Hashimoto, K., and Maki, S.: "Overproduction and affinity purification of Saccharomyces cerevisiae replication factor C." J.Biol.Chem.(in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hashimoto, K., Ohara, T., Maki, S., and Sugino, A.: "The second subunit of DNA polymerase III (delta) is encoded by the HYS2 gene in Saccharomyces cerevisiae." J.Biol.Chem.(in press). (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sugimoto,K.: "Rfc5,a small subunit of replication factor C complex,couples DNA replication and mitosis in budding yeast" Proc.Natl.Acad.Sci.,USA. 93. 7048-7052 (1996)
• [文献書誌] Noskov,V.: "The RFC2 gene encoding the third largest subunit of the RF-C complex is required for chromosomal DNA replication and cell cycle checkpoint" Mol.Cell Biol.17(in press). (1997)
• [文献書誌] Lei,M.: "Mcm proteins are phosphorylated by Dbf4/Cdc7 protein kinase at the G1/S transition in Saccharomyces cerevisiae" Cell. (in press). (1997)
• [文献書誌] Sugimoto,K.,et al.: "RFC 5,a small subunit of replication factor C complex,couples DNA replication and mitosis in budding yeast." Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.92(in press). (1996)