| 研究課題/領域番号 |
07558109
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
神経・筋肉生理学
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
小澤 瀞司 群馬大学, 医学部, 教授 (40049044)
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| 研究分担者 |
都築 馨介 (都筑 馨介) 群馬大学, 医学部, 講師 (60222139)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
9,900千円 (直接経費: 9,900千円)
1996年度: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円)
1995年度: 6,100千円 (直接経費: 6,100千円)
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| キーワード | mRNA / 定量的測定法 / 逆転写-遺伝子増幅 / 内部標準 / AMPA / グルタミン酸受容体 / GluR2 / 単一ニューロン / RT-PCR / ホールセルパッチクランプ / 海馬スライス / ニューロン / 受容体サブユニット / 逆転写 / 遺伝子増幅 / オートラジオグラフィー / パッチピペット / 単一ニューロンRT-OCR |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、単一ニューロンに発現する特定の神経伝達物質受容体サブユニットmRNAの量を定量的に測定する方法を開発することにある。具体的には、回収された細胞質に内部標準物質となる既知の濃度のRNAを加え、この混合物に逆転写遺伝子増幅(RT-PCR)を行い、増幅されたmRNA由来のPCR産物と内部標準物質由来のPCR産物の比を高感度イメージングプレートを用いて計測し、細胞質に含まれるmRNAの絶対量を決定しようとするものである。主要な成果は以下の通りである。
1) ラット脳を対象とした内部標物質GluR2StuI RNAの使用によるAMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2 mRNAの定量的定法の確立: 野生型GluR2プラスミドの2098番目の塩基のシトシンをグアニンに変換させたGluR2をEckstein法により作製した。作製された変異GiuR2は野生型にはない制限酵素StuIによる切断部位をもつので制限酵素解析により内在性のGluR2と区別され得るとともに、PCRによる増幅効率が野生型と等しいので、これからin vitro合成したRNAを内部標準物質として使用することができた。この内部標準物質を用いてラット前脳及び小脳のGluR2 RNAの発現量を測定し、RNA 1ng中にはそれぞれ1.0×10^5分子、1.6×10^4分子のGluR2 mRNAの存在することを明らがかにした。
2) 培養ラット海馬単一ニューロンに発現するGluR2 mRNAの定量的測定:1)で確立した方法を単一ニューロンレベルでの測定に応用した。培養16-19日目の十分成熟した錐体ニューロンで全細胞パッチクランプ記録を行い、この後細胞質をパッチピペットに吸引し、そこに含まれるGluR2 mRNA の量を測定した。11個のニューロンの測定で検出されたGluR2 mRNAは100-3000分子であり、平均値は1015±317(mean±SE)分子であった。
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