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蛋白工学的手法を活用した迅速な蛋白質結晶構造解析の新手法

研究課題

研究課題/領域番号 07559006
研究種目

基盤研究(B)

配分区分補助金
応募区分試験
研究分野 広領域
研究機関長岡技術科学大学

研究代表者

三井 幸雄  長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637)

研究分担者 千田 俊哉  長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
石野 良純  (株)宝酒造, バイオ研究所, 主任研究員
研究期間 (年度) 1995 – 1996
研究課題ステータス 完了 (1996年度)
配分額 *注記
6,300千円 (直接経費: 6,300千円)
1996年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1995年度: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
キーワード蛋白質工学 / 蛋白工学 / X線解析 / 結晶構造解析 / 蛋白質の立体構造 / セレノメチオニン
研究概要

本研究では、蛋白質工学的手法を蛋白質X線結晶学に取り入れることにより、試行錯誤に頼らず位相決定と電子密度図の解釈の2つの問題を同時に解決できる方法の開発を目指した。具体的には、セレノメチオニン等セレン含有蛋白質を蛋白質工学的に作成し、このセレン含有蛋白質を結晶してX線結晶構造解析に用いることにより、上記の目的を達成することを目指した。
研究は、実際に蛋白質の構造解析に本方法を適用することで、その有効性を確認するという手段をとった。解析を行った蛋白質は、微生物のPCB(ビフェニル骨格を持つ公害物質)の分解代謝系に存在するBphC酵素(総分子量25万)、BphD酵素(総分子量25万)の2つで、これらの立体構造解析を通じて、本方法の有効性を確かめた。両酵素の構造解析には、セレノメチオニン蛋白質を用い、データ測定は全て、実験室系の通常のX線発生装置を用いて行った。その結果、放射光実験施設を用いることなく、セレン含有蛋白質を位相決定に有効に用いることが可能であることを実証できた。また、電子密度図の解釈に於いても、これを、正確かつ迅速に行うのにセレン含有蛋白質が非常に有効であることを確認した。
また、解析の効率化の過程で用いられる、電子密度図の改良用プログラムに関しても検討を行った。その結果、これらのプログラムは、初期位相の質が良くないと、正しい結果を得ることができないことを確かめた。このため、現段階では、放射光実験施設を用いて異常分散の測定実験を行わない限り(実験室系のX線発生装置を用いるならば)セレノメチオニン蛋白質単独で(SIRを用いて)位相を決定するのは困難であることがわかった。しかし、既に重原子同型置換体が得られている場合は、セレノメチオニン蛋白質を用いることで、位相の改善を十分行いうることが明らかになった。また、このようにして、改善された位相に対しては、電子密度図の改良(Solvent flattening等)は、ある程度有効に働くことも確認した。

報告書

(3件)
  • 1996 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1995 実績報告書
  • 研究成果

    (35件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (35件)

  • [文献書誌] Tanaka, N., Nonaka, T., Yoshimoto, T., Tsuru, D. & Mitsui, Y.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of 7α-hydroxysteroid dehydrogenase from E. coli." Acta Crystallogr.D52. 215-217 (1996)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Senda, T., Sugiyama, K., Narita, H., Yamamoto, T., Kimbara, K., Fukuda, M., Sato, M., the late Yano, K. & Mitsui, Y.: "Three-dimensional structures of free form and two sustrate complexes of an extradiol ring-cleavage type dioxygenase, the BphC enzyme from Pseudomonas sp. strai KKS 102." J. Mol. Biol.255. 735-752 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kurihara, J., Nonaka, T., Mitsui, Y., Ohgi, K., Irie, M. & Nakamura, K. T.: "Crystal structure of ribonuclease from Rhizopus niveus at 2.0 A resolution." J. Mol. Biol.255. 310-320 (1996)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, N., Nonaka, T., Nakanishi, M., Deyashiki, Y., Hara, A. & Mitsui, Y.: "Crystal structure of the ternary comnplex of mouse lung carbonyl reductase at 1.8 A resolution : The structural origin of distinct coenzyme specificities among the enzymes of the short-chain dehydrogenase/reductase family." Structure. 4. 33-45 (1996)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Orita, M., Nishikawa, F., Kohno, T., Senda, T., Mitsui, Y., Endo, Y., Taira, K. & Nishikawa, S.: "High-resolution NMR study of a GdA GA tetranucleotide loop that is an improved substrate for ricin, a cytotoxic plant protein." Nucleic Acid Research. 24. 611-618 (1996)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, N., Nonaka, T., Tanabe, T., Yoshimoto, T., Tsuru, D. & Mitsui. Y.: "Crystal structures of the binary and ternary complexes of 7α-hydroxy-steroid dehydrogenase from E. coli." Biochemistry. 35. 7715-7724 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakanishi, M., Kakumoto, M., Matsuura, K., Deyashiki, Y., Tanaka, N., Nonaka, T., Mitsui, Y. & Hara, A.: "Involvement of two basic residues (Lys-17 and Arg-39) of mouse lung carbonyl reductase in NADP (H)-binding and fatty acid activation : Site-directed mutagenesis and kinetic analyses." J. Biochem. (Tokyo). 120. 257-263 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakanishi, M., Matsuura, K., Kaibe, H., Tanaka, N., Nonaka, T., Mitsui, Y. & Hara, A.: "Awitch of coenzyme specificity of mouse lung carbonyl reductase by substitution of Threonine 38 with Aspartic acid." J. Biol. Chem.272. 2218-2222 (1997)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kohno, T., Senda, T., Mitsui, Y. et al.: "Three-dimensional structure of abrin-a A-chain having ribosome inactivating activity." Proc. Japan Acad.71B. 104-107 (1995)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Senda, T., Saitoh, S. & Mitsui, Y. et. al.: "Refined crystal structure of recombinant murine interferon-beta at 2.15 A resolution." J. Mol. Biol.253. 187-207 (1995)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Senda, T., Mitsui, Y., Roberts, R. M. et al.: "A three-dimensional model of bovine interferon-tau." J. Interferon & Cytokine Res.15. 1053-1060 (1995)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Senda, T., Sugiyama, K., Mitsui, Y., et al.: "Three-dimensional structure of an extradiol ring-cleavage type dioxygenase, the Bph C enzyme from Pseudomonas" J. Mol. Biol.255. 735-752 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Senda, T. & Mitsui,.: "“Molecular Biology of Pseudomonas" (T. Nakazawa et al., eds.) Chapter 27," ASM Press, Washington D. C., 500 (311-318) (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, N., Nonaka, T., Yoshimoto, T., Tsuru, D.& Mitsui, Y.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase from E.coli." Acta Crystallogr.D52. 215-217 (1996)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Senda, T., Sugiyama, K., Narita, H., Yamamoto, T., Kimbara, K., Fukuda, M., Sato, M., the late Yano, K.& Mitsui, Y.: "Three-dimensional structures of free form and two sustrate complexes of an extradiol ring-cleavage type dioxygenase, the BphC enzyme from Pseudomonas sp. strain KKS102." J.Mol. Biol.255. 735-752 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kurihara, J., Nonaka, T., Mitsui, Y., Ohgi, K., Irie, M.& Nakamura, K.T.: "Crystal structure of ribonuclease from Rhizopus niveus at 2.0A resolution." J.Mol. Biol.255. 310-320 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, N., Nonaka, T., Nskanishi, M., Deyashiki, Y., Hara, A.& Mitsui, Y.: "Crystal structure of the ternary comnplex of mouse lung carbonyl reductase at 1.8A resolution : The structural origin of distinct coenzyme specificities among the enzymes of the short-chain dehydrogenase/reductase family." Structure. 4. 33-45 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Orita, M., Nishikawa, F., Kohno, T., Senda, T., Mitsui, Y., Endo, Y., Taira, K.& Nishikawa, S.: "High-resolution NMR study of a GdA GA tetranucleotide loop that is an improved substrate for ricin, a cytotoxic plant protein." Nucleic Acid Research. 24. 611-618 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, N., Nonaka, T., Tanabe, T., Yoshimoto, T., Tsuru, D.& Mistui, Y.: "Crystal structure of the binary and ternary complexes of 7alpha-hydroxy-steroid dehydrogenase from E.coli." Biochemistry. 35. 7715-7724 (1996)

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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Senda, T.& Mitsui.: "Three-dimensional structure of the 2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenase (BphC enzyme) from the polychlorinated biphenyl-degrading organism Pseudomonas sp. strain KKS102." "Molecular Biology of Pseudomonas" (T.Nakazawa et al., eds.) Chapter 27 ASM Press, washington D.C.311-318 (1996)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakanishi, M., Kakumoto, M., Matsuura, K., Deyashiki, Y., Tanaka, N., Nonaka, T., Mitsui, Y.& Hara, A..: "Involvement of two basic residues (Lys-17 and Arg-39) of mouse lung carbonyl reductase in NADP (H) -binding and fatty acid activation : Site-directed mutagenesis and kinetic' analyzes." J.Biochem. (Tokyo). 120. 257-263 (1996)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakanishi, M., Natsuura, K., Kaibe, H., Tanaka, N., Nonaka, T., Mitsui, Y.& Hara, A.: "Switch of coenzyme specificitiy of mouse lung carbonyl reductase by substitution of Threonine 38 with Aspartic acid." J.Biol. Chem.272. 2218-2222 (1997)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1996 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka,N.,Nonaka,T.,Yoshimoto,T.,Tsuru,D. & Mitsui,Y.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of 7α-hydroxysteroid dehydrogenase from E.coli." Acta Crystallogr.D52. 215-217 (1996)

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      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Senda,T.,Sugiyama,K.,Narita,H.,Yamamoto,T.,Kimbara,K.,Fukuda,M.,Sato,M.,the late Yano,K. & Mitsui,Y.: "Three-dimensional structures of free form and two sustrate complexes of an extradiol ring-cleavage type dioxygenase,the BphC enzyme from Pseudomonas sp.strai KKS102." J.Mol.Biol.,. 255. 735-752 (1996)

    • 関連する報告書
      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Kurihara,J.,Nonaka,T.,Mitsui,Y.,Ohgi,K.,Irie,M. & Nakamura,K.T.: "Crystal structure of ribonuclease from Rhizopus niveus at 2.0 A resolution." J.Mol.Biol.255. 310-320 (1996)

    • 関連する報告書
      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Tanaka,N.,Nonaka,T.,Nakanishi,M.,Deyashiki,Y.,Hara,A. & Mitsui,Y.: "Crystal structure of the ternary comnplex of mouse lung carbonyl reductase at 1.8 A resolution : The structural origin of distinct coenzyme specificities among the enzymes of the short-chain dehydrogenase/reductase family." Structure. 4. 33-45 (1996)

    • 関連する報告書
      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Orita,M.,Nishikawa,F.,Kohno,T.,Senda,T.,Mitsui,Y.,Endo,Y.,Taira,K. & Nishikawa,S.: "High-resolution NMR study of a GdAGA tetranucleotide loop that is an improved substrate for ricin,a cytotoxic plant protein." Nucleic Acid Research. 24. 611-618 (1996)

    • 関連する報告書
      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Tanaka,N.,Nonaka,T.,Tanabe,T.,Yoshimoto,T.,Tsuru,D. & Mitsui.Y.: "Crystal structures of the binary and ternary complexes of 7α-hydroxy-steroid dehydrogenase from E.coli." Biochemistry. 35. 7715-7724 (1996)

    • 関連する報告書
      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Senda,T. & Mitsui,.: ""Molecular Biology of Pseudomonas" (T.Nakazawa et al.,eds.) Chapter 27,pp.311-318" ASM Press,Washington D.C., 500 (1996)

    • 関連する報告書
      1996 実績報告書
  • [文献書誌] Kohno,T.,Senda,T.,Mitsui,Y. et al.: "Three-dimensional structure of abrin-a A-chain having ribosome inactivating activity." Proc. Japan Acad.71B. 104-107 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Senda,T.,Saitoh,S.& Mitsui,Y. et al.: "Refined crystal structure of recombinant murine interferon-beta at 2.15 A resolution." J. Mol. Biol.253. 187-207 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Senda,T.,Mitsui,Y.,Roberts,R.M. et al.: "A three-dimensional model of bovine interferon-tau." J. Interferon & Cytokine Res.15. 1053-1060 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Senda,T.,Sugiyama,K.,Mitsui,Y. et al.: "Three-dimensional structures of an extradiol ring-cleavage type dioxygenase, the Bph C enzyme from Pseudomonas." J. Mol. Biol.255. 735-752 (1996)

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      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Kurihara,J.,Mitsui,Y.,Nakamura,K.T. et al.: "The crystal structure of ribonuclease from Rhizopus niveus at 2.0 A resolution." J. Mol. Biol.255. 310-320 (1996)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Tanaka,N.,Nonaka,T.,Mitsui,Y. et al.: "Crystal structure of the ternary complex of mouse lung carbonyl reductase at 1.8 A resolution." Structure. 4. 33-45 (1996)

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      1995 実績報告書

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公開日: 1995-04-01   更新日: 2016-04-21  

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