| 研究課題/領域番号 |
07660109
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
井上 國世 京都大学, 農学部, 教授 (10223249)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1996年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1995年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | 好塩性酵素 / サーモライシン / 金属プロテイナーゼ / 基質特異性 / 酵素活性 / プロテアーゼ / 化学修飾 / チロシン / 好熱性酵素 |
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| 研究概要 |
1.塩によるサーモライシン(TLN)の活性化に対する基質特異性:切断部位ペプチド結合のアミノ酸を変化させた基質を合成した。良い基質と悪い基質では、活性に1万倍程度の差があるが、塩による活性度はほぼ同じであり、活性化は切断部位ペプチド結合のアミノ酸残基には依存しない。酵素活性は切断部位のアミノ酸残基の疎水性が大きいほど大きいが、塩添加において、この疎水性は活性化に影響せず、塩は基質と酵素活性中心との相互作用に直接関与しないことが示唆された。
2.TLN活性化におけるカチオンとアニオンの効果: TLN活性化に対するイオンの効果を比較した。カチオンではNa^+>K^+>Li^+の順となり、アニオンではCl^->Br^-の順となった。アニオンではイオン半径が小さい方が活性化効果が大きいが、カチオンでは活性化とイオン半径(Na^+<Li^+<K^+)との間に直接的な関係が認められず、酵素とイオン間の相互作用が重要であると推定された。
3.溶解度と分子量への効果: TLNは通常の緩衝液では1mg/mL程度の溶解度である。塩類添加により溶解度は飛躍的に増大することから、TLNは極度に疎水的な蛋白質であると考えられる。レーザ散乱法により塩存在下の分子量を測定した。塩の有無に拘わるTLNの解離会合は認められなかった。
4.静電気相互作用の関与: TLNの活性はベル型のpH依存性を示すが、塩による活性化度も中性で最大(16倍)のベル型で、pH 6と9では2倍となる。温度を5から35°Cまで上昇させると、活性は上昇するが活性化度は20倍から4倍に低下する。アルコール添加により活性化度は低下する。塩の存在下において酵素とイオンの静電的相互作用がTLNの活性化に影響を及ぼすと考えられる。
5.TLNのチロシン残基(Tyr)の化学修飾: TLNの28残基のTryをニトロ化およびアミノ化してイオン化の度合を変化させた。ニトロ化による負電荷導入により活性化度は低下したが、これをアミノ化すると活性化度はもとのレベルに回復した。塩による活性化は負電荷の導入につれ低下する。
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