| 研究課題/領域番号 |
07660124
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
深溝 慶 近畿大学, 農学部, 助教授 (50181243)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
1996年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
1995年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | キトサナーゼ / キトオリゴ糖 / 部位特異的変異導入 / 触媒部位 / 熱変性 / 定常状態速度論 / 部位特異的変位導入 / オリゴ糖 / キトサン / 加水分解機構 |
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| 研究概要 |
Streptomyces sp.N174から得られたキトサナーゼ遺伝子を組み込んだStreptomyces lividans TK24によってキトサナーゼを大量に発現させ、S-Sepharose Fast FlowおよびBio Gel Aによるカラムクロマトグラフィによって本酵素を精製した。得られたキトサナーゼとグルコサミンオリゴ糖を反応させ、生成物のアノマー型を調べたところ、a型の生成物が得られ、本酵素は加水分解にともないアノマー型を反転させるということがわかった。グロコサミンのヘキサマーを基質として反応させてみると、生成物の濃度分布はトリマ->>ダイマー>テトラマ-の順であり、ペンタマ-からは等モル濃度のダイマーとトリマ-が、テトラマ-からはダイマーが生成された。基質の重合度が高くなるにつれて、分解の初速度は増大し、本酵素は少なくとも6個のサブサイトを持っていると思われた。
本酵素の触媒活性発現のために重要な役割をはたしているアミノ酸残基を同定するために、いくつかの酸性アミノ酸残基に部位特異的変異導入を行い、活性の変動を調べてみた。その結果、Glu22とAsp40の変異体においていちじるしい活性の低下がみられ(0.2-0.7%)、これら二つのアミノ酸残基が触媒残基であると推定できた。また、Asp37の変異体においてもかなりの活性の低下がみられ(30-50%)、熱安定性もかなり低下した。本酵素のX線結晶構造において、Asp37はHis90と近接しており、これらの残基間で相互作用を行うことによってタンパク質構造を安定化しているものと考えられた。
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