研究課題/領域番号 |
07670007
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
研究分野 |
解剖学一般(含組織学・発生学)
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研究機関 | 山梨医科大学 |
研究代表者 |
大野 伸一 山梨医科大学, 医学部, 教授 (50109170)
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研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
1996年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1995年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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キーワード | 新鮮無固定赤血球 / 膜骨格 / ディープエッチング法 / 急速凍結技法 / スペクトリン / デイ-プエッチング法 |
研究概要 |
従来から赤血球膜裏打ち構造の形態学的研究では、樹脂包埋後の染色切片による透過型電顕法、あるいは赤血球膜脂質を界面活性剤で除去させた後に走査型電顕で観察する方法があった。本研究では、独自に開発した急速凍結・ディープエッチング法を使い、新鮮無固定赤血球膜を免疫細胞化学的に検索した。平成7年度には、新鮮無固定赤血球膜細胞質側を高解像力で三次元的に解析する方法を開発し、さらに赤血球膜骨格蛋白の抗体を作成した。平成8年度には、膜骨格蛋白の免疫染色標本により、その局在と結合様式を明らかにした。(1)ヒト新鮮無固定赤血球ペレットを遠沈して作成した。(2)赤血球内可溶性蛋白質を除去するために、グルタールアルデヒドとアミノプロピルトリエトキシシランを被覆した2枚のカバーガラス間で、赤血球をはさみ二分割した。(3)平成7年度に作成されたスペクトリン等に対するモノクロナール抗体で免疫染色した。(4)次いで液体窒素冷却イソペンタン・プロパン混合液(約-193℃)中で急速凍結した。(5)ターボ分子ポンプ装備エイコ-社製FD-3AS装置内(-95℃、2-6X10^<-7>Torr)で15〜30分間ディープエッチング(氷を昇華)をかけた。(6)白金(角度24°)と炭素(角度90°)を回転蒸着して、型のごとくレプリカ膜を作製した。(7)日立H-8100電顕でレプリカ膜よりステレオ写真を撮影し、三次元的解析を行った。これにより、固定により修飾を受けない新鮮無固定赤血球膜細胞質側に局在し、外力により動的に変化するin situスペクトリン網目状構造を明らかにすることができた。
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