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ラット卵巣から、コラゲナーゼ処理によって2-3層の顆粒膜細胞を有する卵胞を単離し、2%血清存在下に浮遊状態で培養を行った。培養後、卵胞の組織切片を作成し顕微鏡下で卵胞の形態および大きさの変化、さらに顆粒膜細胞のAppoptosisの有無を定量的に測定し、細胞増殖、分化、細胞死それぞれの活性の指標とする。DESを投与したラット1000匹から卵巣を集め、DES刺激した卵巣の抽出物を得た。この抽出物中には、顆粒膜細胞に対する増殖因子および細胞死因子が高濃度に含まれていた。またPMSGを投与したラット1000匹からも卵巣を集め、PMSG刺激した卵巣の抽出物を得た。これらの抽出物中より顆粒膜細胞に対する増殖因子、分化因子、細胞死因子をそれぞれ上記のアッセイシステムを用いて精製を試みた。
まず抽出液をDEAEおよびCM-Sepharoseによるイオン交換クロマトグラフィーにより分画し、さらにゲル濾過、Hysrophobicクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより精製した。
高速液体クロマトグラフィーによって、最終的に精製された標品を得た。精製された標品をアミノ酸シークエンサーで分析し、部分アミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列の情報をもとにオリゴヌクレオチドプローブを合成し、卵巣のcDNAライブラリーから、これら増殖、分化、細胞死の各因子のcDNAをクローニングすることを現在試みている。得られたcDNAの塩基配列をDNAシークエンサーを利用して決定し、各因子の構造を明らかにしたい。
さらにこれらのcDNAを発現ベクターに組み込み、動物細胞で発現させ、これらの因子の作用機構の解明に利用して行きたい。
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