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ポリアクリルアミドゲル電気泳動と免疫汎降による蛋白質の簡便な精製法

研究課題

研究課題/領域番号 07672327
研究種目

一般研究(C)

配分区分補助金
研究分野 物理系薬学
研究機関帝京大学

研究代表者

瀬高 守夫  帝京大学, 薬学部, 教授 (70012630)

研究期間 (年度) 1995
研究課題ステータス 完了 (1995年度)
配分額 *注記
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1995年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
キーワードポリアクリルアミド電気泳動 / 蛋白質の簡便な精製法 / 免疫沈降
研究概要

1.ポリアクリルアミド電気泳動(SDS PAGE)精製装置の作製
当初予定していた精製の手順、「大型電気泳動装置の作製及び大量蛋白試料の泳動」「泳動ゲルから特定蛋白バンドのゲル片の切り出し」「溶出槽の作製及びゲル片から目的蛋白の溶出」を変更し、一段階で蛋白を精製するサブマリン型(水平型)調整用大型SDS PAGE精製装置を完成させた。縦20cm×横20cm×厚さ2cmの平板型ゲルを作り、初めは通常の縦型に泳動する。試料に平行して着色したプレステインマーカーを泳動し、その位置から、泳動中の蛋白の分離状態及び目的蛋白バンドの位置を推定する。目的蛋白が適切な位置に来たら、ゲルを水平に設定し、サブマリン型電気泳動を行なう。目的バンドの下流のゲルに溝を作り、目的蛋白を溝のバッファー中に回収する。本法を以下の蛋白精製に適用した。
2.大腸菌膜結合性ホスホリパーゼA(DRPLA)の精製
DRPLAはSDSで可溶化しても失活しないので、本精製法は特に有効であった。即ち、大腸菌ペレットをフレンチプレスで破菌し、膜画分を遠心にて集め、SDSで可溶化し、アセトン分画し、Mono Qカラム充填剤によるバッチ式吸着精製を行い、粗分画を得た。この試料にSDS PAGE精製を適用し、多数の蛋白バンドから成る粗画分より29KDに単一バンドをもつ、DRPLAを得ることが出来た。従来、各種カラムを繰り返すことにより精製された蛋白が、一本のカラムをかけることなく精製され、本精製法の有用性が示された。論文発表する予定である。
3.PAF・アセチルトランスフェラーゼ(AT)精製
一方、AT酵素はSDSで失活するので本精製法が直接適用できない。ここではAT酵素を同定するのに免疫沈降を利用し、SDS PAGE精製法と組み合わせることにより、有効な精製法が開発できると思われる。現在、予備実験中である。

報告書

(1件)
  • 1995 実績報告書

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公開日: 1995-04-01   更新日: 2016-04-21  

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