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レトロウイルス逆転写酵素及び各種DNAポリメラーゼに対する光親和性標識試薬の開発

研究課題

研究課題/領域番号 07680639
研究種目

一般研究(C)

配分区分補助金
研究分野 生物有機科学
研究機関西東京科学大学

研究代表者

山口 十四文  西東京科学大学, 理工学部, 助手 (90230367)

研究分担者 実吉 峯郎  西東京科学大学, 理工学部, 教授 (20002339)
研究期間 (年度) 1995
研究課題ステータス 完了 (1995年度)
配分額 *注記
1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1995年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
キーワードレトロウイルス / 逆転写酵素 / DNAポリメラーゼ / 光親和性標識 / ジアジリン / カルベン / ヒト免疫不全ウイルス / dTTP結合部位
研究概要

DNAポリメラーゼ類の基質結合部位に反応する光親和性標識試薬の開発を目指した。
1.dTTPアナログとしての、5-(p-(3-トリフルオロメチルジアジリン-3-イル)スチリル)-2′,3′-ジデオキシチミジン 5′-トリりん酸(TDSddUTP)を合成した。次に、鋳型・プライマーとしてポリA・オリゴdTを使用し、ヒト免疫不全ウイルス1型逆転写酵素(RT)について調べると、以下に示す成果が得られた。
2.TDSddUTPの、暗所におけるRTの阻害は、dTTPに拮抗し、dTTPに比較して180倍強い親和性を示した。dTTPの5位へのスチリル基の導入はRTに対する親和性を高めることが明らかとなった。また、DNAポリメラーゼγに対しても高い親和性を示した。
3.RTに対する光親和性標識実験を行うと、0.025mMマグネシウムイオン存在下、RTのdTTP結合部位に共有結合することが判明した。一方、4mMマグネシウムイオン存在下、TDSddUTPがプライマー3′末端に取り込まれ、光反応性オリゴデオキシヌクレオチドが生成し、光照射によって、プライマーがRTに共有結合した生成物を与えた。つまり、共存するマグネシウムイオン濃度によって、TDSddUTPは異なる挙動を示す光親和性標識試薬であることが判明した。
いずれの標識実験においても、RTの66kDのサブユニットに結合した。この結果は、RTが66kDにポリメラーゼ触媒部位を有するという知見に合致する。以上のように、TDSddUTPは、RTの基質結合部位に反応することが判明し、RTのヌクレオチド結合部位のみならずDNA(プライマー)結合部位の構造および酵素学的研究に応用可能なプローブであることが明らかとなった。この方法論は、様々なDNAポリメラーゼに拡張可能であろう。

報告書

(1件)
  • 1995 実績報告書
  • 研究成果

    (2件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (2件)

  • [文献書誌] Toyofumi Yamaguchi et al.: "Photoaffinity labeling of HIV reverse transcriptase: utilization of 2′,3′-dideoxyuridylate analog bearingaryl(trifluoromethyl)diazirine moiety as a chain terminator." Nucleic Acids Symposium Series. 34. 75-76 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] T. Yamaguchi & M. Saneyoshi: "Synthetic nucleosides and nucleotides. XXXIV. Photoaffinity labeling of HIV reverse transcriptase: synthesis and utilization of 2′,3′-dideoxyuridylate analogs beaning aryl(trifluoromethyl)diazirine moiety." Nucleosides and Nucleotides. 15. 607-618 (1996)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書

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公開日: 1995-04-01   更新日: 2016-04-21  

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