| 研究概要 |
1)好酸性細菌の制限修飾系遺伝子のクローンニング及び一次構造解析
Afa22MI制限修飾系遺伝子のクローニングをハンガリアンメソッドにより行った。その結果,メチラーゼ(MTase)遺伝子を保持する組み換えプラスミドが得られた。塩基配列の解析を行った結果,MTase遺伝子の上流に本酵素のイソチゾマ-であるXorllのvsr(very short patch repair)endonuclease like proteinと相同性の高い配列が存在していた。また推定されるメチラーゼのアミノ酸配列もM.Xorllと相同性が高く,C5-メチラーゼのconsensus motifがよく保存されており,本酵素がシトシンメチラーゼであることが示唆された。
2)M.Afa22MI及びM.Afa16RIの精製・性質検討
同属同種で同じ配列を認識するM.Afa22MI及びM.Afa16RIの精製を行い,性質検討した。最適温度等の反応最適条件を決定することができた。
3)MALDI-TOF MSによるメチル化部位の決定法の確立
従来のメチル化部位の決定法は、放射性同位体を用い大変煩雑である。我々はメチル基の導入で分子量が+14.01Da増加することに着目し,MALDI-TOF MSを用いたメチル化塩基の決定法を確立することに成功した。
4)制限酵素の結晶化
制限酵素Aor13HIの結晶化条件の検討を行った。結晶化条件は緩衝液として100mM HEPES(pH7.5,8.0),沈殿剤としてPEG4000もしくはPEG6000を用いた。またタンパク質溶液中には終濃度1mM EDTA,5% glycerol,90nM oligonucleotideを添加し,20°Cでハンギングドロップ法により結晶化条件の検討を行った。その結果100mM HEPES(pH8.0),100mM NaCl,10%PEG4000またはPEG6000の条件下で板状の結晶の生成が確認できた。
|
