| 研究概要 |
フェノール酸化酵素前駆体活性化系(proPOカスケード)は昆虫の生体防御の要であり、無脊椎動物の体液などに存在する。このカスケードはカビや細菌の細胞壁成分により活性化され、これら異物成分各々に対する認識蛋白質と複数のプロテアーゼ前駆体によって構成されていることは判明しているが、詳細は明かではない。本研究は(1)このカスケード系の最前線に位置する異物認識蛋白質のcDNAクローン化と全一次配列構造の解明、及び(2)カスケード初期反応に関与する因子を同定するためにカスケードの再構成系の確立に努めた。
(1)カビを認識する蛋白質(β-1,3-glucan recognition protein;β(GRP)のcDNAクローン化と全一次配列構造の解明…カイコ血球細胞よりmRNAを抽出後、cDNAライブラリーを作製した。βGRPの部分アミノ酸配列を参考したオリゴヌクレオチドプローブを用いてPCR法を行い、スクリーニング用のプローブを得た。cDNAライブラリーよりβGRPのcDNAクローン化を行い、塩基配列及び全アミノ酸配列を決定した。βGRPの末端側35kDa部分は細菌由来β-1,3-glucanaseやカブトガニ体液凝固系factor Gと相同性があった。また、ノーザンブロット解析の結果よりβGRPは血球細胞、脂肪体、真皮細胞で合成されていることが明らかになった。
(2)カスケードの再構成系の確立・・・カイコ体液より調整した血漿成分を、原理の異なる数種のカラムを連結したものに供することにより、カスケードの構成成分を不活性なまま7画分に分けることに成功した。この方法で得た画分を用いた再構成系は上記の異物成分で活性化され、分画前の血漿成分に含まれるカスケードと同じ性質を有していることが明らかになった。また、これらの画分のうち3つの画分にこれまで検出できなかった未知因子の活性を見いだし、現在、これらの活性を示す構成因子を精製中である。
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