| 研究概要 |
申請者は,RTEM-1β-ラクタマーゼE166N変異体が基質であるペニシリンと安定なアシル中間体を形成することを見いだし、その立体構造をx線結晶構造解析により決定した(Nature 359, 700-705 (1992) )。その構造からSer130側鎖の-OHが前半のアシル化の開環反応で基質のNへのproton donorと考えられ,実際にS130T変異体では、Kmの変化なしにkcatが約1/100に減少した(投稿準備中)。本研究は,このS130T変異体を利用し,低温条件下、^<13>C-NMRにより,蓄積しているはずの正四面体中間体の形成を検出して,予想した反応機構を検証することを目的とする。本年度は,基質のベンジルペニシリンのβ-ラクタム環のカルボニル炭素を^<13>Cで標識した化合物の合成の検討を行った。まず,化学合成によるコールドランを試みたところ,β-ラクタム化合物は非常に不安定で,合成収率が悪いため,原料物質である^<13>C標識化合物の単価を考えると,予算内では十分量合成できないことがわかった。そこで,次に発酵生産を検討した。これは,ペニシリンの生産菌に,安価な^<13>C標識クロレラを食べさせて,その培養から,ペニシリンを精製する方法である。この場合,目的部位以外にも標識が入るが,それらを同定するのは簡単なので,予算を考えてこの方法をとることにした。現在,^<13>CO_2でクロレラを培養して標識クロレラを調整中である。
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