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BGM細胞に0.001〜0.1%濃度の界面活性剤Triton X-100 (TX100)を加え、鏡検により細胞の破砕を観察した。Coxiella burnetii Nine Mile II相菌(ATCC VR-616)の培養上清(細胞外の菌体が主体)、及び感染BGM細胞(細胞内の菌体が主体)を別々に回収した。
培養上清について各々0.001〜0.01%濃度のTX100を加えた試料と無添加の試料を遠心後、PCRを行った結果、無添加の場合と検出感度に差は無かった。
感染細胞では0.01、0.02%のTX100を加え遠心した試料、免疫鉄ビーズで菌体を回収した(この方法についてはVeterinary microbiologyに掲載決定)。試料、及びTX100添加後、免疫鉄ビーズで菌体を回収した試料でPCRを行った。0.01%濃度のTX100を加えた試料では、TX100無添加で免疫鉄ビーズにより菌体回収した試料と比べPCRの結果、検出感度の上昇が見られた。また、0.01%TX100は免疫鉄ビーズと菌体の反応を阻害しないことが判った。牛乳の場合、0.01%TX100のみ添加では遠心後に大量の堅固なpelletが残り、PCRサンプル調整の妨げになると共に検出感度が低下した。牛乳からのPCR-ELISAサンプル調整では0.01%TX100添加+免疫鉄ビーズによる菌体回収で検出感度が良かった。
ウシ60頭の生乳から、この方法によりサンプル調整し、PCR-ELISAによりC. burnetii検出を行った。PCR-ELISAは先に提出した申請書に記載した方法に準じて行った。10頭が陽性で(陽性率16.7%)、うち5頭が強陽性であった。PCR-ELISAは高感度に、多数の試料の判定が出来る利点を持つ。(以上の結果について第121回日本獣医学会で発表予定。Applied and environmental microbiologyに投稿準備中。)
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