| 研究概要 |
われわれは、GPEIに結合する因子の解析を行い、肝癌細胞AH66と正常肝で比較検討したところ複数の因子がGPEIに結合することを見いだした。フットプリント法の結果より、1)GPEIのTRE-like配列に結合する因子、2)GPEIのTRE-like配列の20-50bp上流に結合する複数の因子を同定した。1)の因子は肝癌と正常肝でフットプリント上では差が認められないが、2)の因子は両者の間でフットプリント上で明らかな差が認められる。1)の因子はさらにDEAE-Sepharoseに結合するものとそうでないものに分かれる。これらの結果、GPEIに結合する因子は少なくとも4種類はあることが明らかとなった。
我々の目的とする因子を同定するためには、それぞれの因子がGST-Pの転写活性化に関与しているかを明らかにする必要がある。まず、これらの因子の精製を進めるために、GST-Pを高発現しているAH66細胞をラット腹腔内で培養し、ラット120匹より600mlの核抽出液を調製した。次に、それぞれの因子を分離するために、幾つかのカラムクロマトグラフィーでの結合活性の挙動を検討した。我々の同定した因子の多くは、陰イオン交換樹脂とヘパリンに結合し、これらを用いて部分精製できることが明らかになった。さらに、このように分離した因子の転写活性を調べるために、ラット正常肝より再構成in vitro転写系を構築中である。基本転写因子は、組み換え体TFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIAを大腸菌またはバキュロウイルスの系を用いて精製した。現在これら以外の因子(Pol II,TFIIH,TFIID)をラット肝より精製しており、これらを用いることによって、精製した各の転写活性を検討することができる。
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