| 研究概要 |
本研究では、アマニタ属キノコの有毒成分であるα-アマニチンの人体試料からの抽出法と高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析条件を設定し、HPLC/エレクトロスプレーイオン化(ESI)-質量分析計(MS)による検出を行った。
HPLC装置は島津製LC-10AをMS装置はフィニガンマット製TSQ7000を使用した。カラムはWakosil II 5C18HG(長さ250mm、内径4.6mm、粒径5μm)を用いた。移動相は0.02M酢酸アンモニウム-アセトニトリル(7:3, pH5)で、流量は1ml/分(EIS-MSの場合は0.3ml/分)とした。ヒト全血および尿1mlにα-アマニチン標準品50μgを添加し、蒸留水を全血には9ml、尿では4mlを加え撹拌した後、Sep-Pak C_<18>カートリッジにゆっくり通す。1%酢酸水溶液20mlでカートリッジを洗浄し、5mlのクロロホルム/メタノール(6:4)溶液でα-アマニチンを溶出させる。この溶液を窒素気流下にて蒸発乾固を施し、残渣を1mlの移動相で溶解した後、その20μlをHPLCに供した。
α-アマニチンを303nmでモニターしHPLC検出を行ったところ、全血および尿抽出試料では不純ピークが検出されたが、α-アマニチンのピークとの重複は問題にならなかった。回収率は全血で約43%、尿で約60%であった。次に、MS装置のインターフェイスとして高速原子衝撃法、大気圧イオン法およびESI法にてα-アマニチンの検出を試みたところ、ESIインターフェイスの場合が最も検出感度が高かった。ESI-MSによるα-アマニチンのスペクトルではm/z919の擬分子イオンがベースピークとなった。検出限界は全血および尿において、それぞれ50ng/mlおよび38ng/mlであった。
今回の結果から、ヒト全血および尿からのα-アマニチンの分析にはSep-Pak C_<18>カートリッジによる抽出と、HPLC/EIS-MSによる検出が良好であることが明らかとなった。現在、固相抽出法の回収率の改善を検討しており、高感度で定量性に優れた分析方法の確立を目指すと共に、法医実際例への応用を試みる予定である。
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