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平成5年度の奨励研究(A)交付金による研究により、われわれは唯一の肝特異的なDNAウイルスであるHBVをベクター化し(pGHBV501)、in vitroでの複製を示した。このベクターは異種DNA配列を運搬可能である、培養細胞では複製可能であるが、生体内では複製しえないなど、ベクターとして好ましい条件を備えている。本研究は作成したHBVベクターを元に、その増殖とパッケージング能の改良を目的に研究を行った。(1)宿主培養細胞株の作成:X遺伝子を発現するプラスミドpHBVM101を薬剤耐性プラスミドpSV2-bsrと供にHuH-7株にトランスフェクションし、安定な形質転換体を単離した。このなかからX遺伝子を発現する株を選択し、宿主培養細胞株(HTBM101)とした。(2)パッケージング能の検討:pGHBV501は63bpの異種DNA配列を運ぶことが可能であることを示したが、クローニング可能な制限酵素の部位としてHindIIIのみしか持たないので、新たなクローニング部位を持つプラスミドpGHBV601を作成し、パッケージング可能なDNAの大きさを検討した。用いるDNA断片には、λ/HindIII断片、pMSG-CAT/HindIII-XhoI断片、HCVenv遺伝子断片、GFP遺伝子などを検討した。これらの過程で、λ/HindIII分解物の125塩基対の断片においても、その挿入によりパッケージング能が著しく低下することが判明した。いっぽう、細胞内でのHBVゲノムの複製は750塩基対程度の断片をクローン化した場合でも見られることを示した。(3)HBV遺伝子の変異の単離:Green fluorescent protein(GFP)を用いると、その遺伝子発現を蛍光顕微鏡などによりin situで観察することができる。そこでHBVベクターに野生型GFPおよび蛍光波長の異なる変異型GFP(pS65T)をクローン化したプラスミドを作成した。この2種のプラスミドを同一の細胞に形質転換し、得られた形質転換体の蛍光発光の変化からHBV遺伝子の種々の変異が単離できると考え現在研究を進めている。
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