| 研究概要 |
当初HPLCを用いて競合的RT-PCRにより細胞内Thyroglobulin mRNAの定量を試みた.しかしこの方法は労力,コストがかかり,また再現性が悪いことが判明したため,PCR産物を制限酵素で切断後ゲル電気泳動を行い,Sybr Green Iで染色して蛍光イメージアナライザーで蛍光量を定量する系に切り替えた.
まずこの新しい系での測定感度を甲状腺培養細胞FRTL-5を用いて確認した.ヒト甲状腺より抽出したtotal RNAを用いた競合的RT-PCR法ではThyroglobulin mRNAの量が1.5倍程度異なっていれば明らかに検出できることが確認できた.またTSH刺激後のFRTL-5内のThyroglobulin mRNAの上昇も確認できた.この方法は微量細胞内のmRNAの簡便な定量に有用であると考えられた(投稿準備中).
正常ヒト甲状腺組織,甲状腺癌組織から初代培養を作成し,Dishに付着させた後,無血清培養液で24時間培養し,TSH,IGE-I,EGF等各種リガンドを添加してThyroglobulin mRNAの増減が確認できるか検討した.しかしFRTL-5を用いたときと異なり,データのばらつきが大きく,明らかな増減は確認不可能であった.この原因としては,1)甲状腺初代培養は技術的に困難を伴うことが多く,組織処理の過程でのダメ-ジや培養液の組成が大きな影響を与えた可能性.2)甲状腺細胞,癌細部自体がThyroglobulin mRNAを1.5倍以上にに増減させる程各種リガンドに反応しなかったこと等が考えられた
|
