|
タンパク質製剤を生体内に投与する場合、安定化及び生理的機能の上昇が必要であると思われる。特に活性が向上したタンパク質は、少量投与しただけでその効果が得られるという点で非常に魅力的である。しかし、安定性の研究は比較的よく行われているが、活性向上という面での研究はあまり行われていない。そこで、タンパク質としては一量体でかつ安定な球状タンパク質であるリゾチームをモデルタンパク質として選択し、そのランダム変異体ライブラリーから画期的に活性の上昇した変異体を選択し、その解析を行うことを目的とした。
化学的に全合成したリゾチーム遺伝子を制限酵素SalIを用いて大腸菌クローニングベクターM13へ組み込んだ。このクローンに対して合成オリゴヌクレオチドを用いて変異を導入した。オリゴヌクレオチドは活性部位グルタミン酸35とアスパラギン酸52を含む領域をターゲットにした。その後、変異を与えたDNAを制限酵素SalIで消化しリゾチーム遺伝子を切り出した後、S.cerevisiae酵母発現ベクターpAM82へ組み込み、これをDNAライブラリーとした。これを使って酵母AH22の形質転換を行い、リゾチーム分泌可能な酵母のライブラリーを作製した。リゾチームの基質であるM.luteusをプレートに重層し、そのうえに酵母のシングルコロニーを植えつけ、野生型に対して溶菌した領域(ハロ)が大きいものを選び出した。活性の上昇した酵母菌から抽出した全DNAを用いて、PCR法によりリゾチーム遺伝子を増幅し、塩基配列さらにそれから推測されるアミノ酸配列を決定し、野生型と比較した。その結果、Lys33AsnとAla42Thrの変異体が得られた。今後は、更に領域を広げるとともにスクリーニングを増やす予定である。
|
